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INMUNOHISTOQUIMICA METODOS INMUNOENZ Archivo

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INMUNOHISTOQUIMICA METODOS INMUNOENZ Archivo
INMUNOHISTOQUÍMICA
Métodos inmunoenzimáticos
Bioq. Gerardo Pisani
Métodos inmunoenzimáticos
 Utilizan reacciones enzima-sustrato
 Fundamento: localizar el producto de reacción de
la enzima precipitándolo con un reactivo que
permita su visualización al microscopio
Técnicas de inmunoperoxidasas
Son un conjunto de métodos de inmunomarcación que
tienen en común la enzima peroxidasa.
Cada molécula de peroxidasa es capaz de desdoblar
múltiples moléculas de sustrato.
La peroxidasa es de origen vegetal y es estable y activa a pH
cercano a la neutralidad.
Importancia:
 Altamente sensible.
 Pueden ser aplicadas a cortes incluidos en parafina.
 Costo final bajo.
PEROXIDASA+ AGUA OXIGENADA
(Enz. Reducida)
(Sustrato)
COMPLEJO PRIMARIO
(Oxidación del grupo hemo)
DAB
(Dador de elect.)
COMPLEJO SECUNDARIO
Se disocia
Enz. Reducida
DAB oxidado
Precipitado marrón
insoluble
Solubles en solventes orgánicos: 4-Cl-1-Naftol (Azul) y el
9 etil-3 aminocarbazol (Rojo)
INMUNOFLUORESCENCIA
INMUNOPEROXIDASA
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Menor sensibilidad
Mayor sensibilidad
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Cortes frescos o congelados
Cortes congelados
Cortes incluidos en parafina
Cortes flotantes
Cortes incluidos en parafina
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Pobre conservación de la morfología
Excelente conservación de la
morfología.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Breve conservación de la marcación
Conservación indefinida de la
por pérdida paulatina de la fluorescencia
marcación
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Se utiliza microscopio de fluorescencia
Se utiliza microscopio de campo
claro
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Buena marcación de antígenos
Buena marcación de antígenos
extracelulares y ligandos de membrana
citoplasmáticos y nucleares
------------------------------------------------------------------------------------------------------------ -----------------
Métodos de coloración
Método Directo
Método Indirecto
Métodos de coloración
Método con anticuerpo antiperoxidasa
Métodos de coloración
Complejo peroxidasaantiperoxidasa
Reacción de PAP
Métodos de coloración
Técnicas que utilizan la proteína A
Métodos de coloración
Métodos que utilizan biotina-(strept)avidina
Tecnología LAB o LSAB
Métodos de coloración
Métodos que utilizan biotina-(strept)avidina
Tecnología ABC
Métodos de coloración
FORMAS DE AMPLIFICAR LAS INMUNOMARCACIONES


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



Repitiendo una o dos veces el 2do o 3er paso.
Amplificación catalizada de la señal:
Se realiza la primer reacción con LSAB o ABC.
Se agrega un sustrato fenólico biotinilado
(Biotiniltiramida).
Se depositan fenoles biotinilados insolubles.
Se realiza la segunda reacción con LSAB o ABC.
Se revela con DAB.
Métodos de coloración
Amplificación catalizada de la señal
Métodos de coloración
Tecnología de polímeros conjugados. Método Indirecto
Polímeros polivalente
LOCALIZACIÓN SIMULTÁNEA DE DOS ANTÍGENOS










Realizar un único desenmascaramiento.
Primera determinación:
El antígeno que está en mayor proporción.
Antígeno nuclear.
El anticuerpo primario preferiblemente policlonal.
Revelado con DAB.
Elución ácida (Si se utiliza anticuerpos primarios de la misma
especie).
Segunda determinación:
Revelado con 4-Cl-1-Naftol (Azul) o el 9 etil-3 aminocarbazol
(Rojo).
Montaje en medio acuoso.
INMUNOHISTOQUÍMICA LSAB con recuperación antigénica
-Desparafinación:
3 cambios de xilol 5’ c/u.
2 cambios de alcohol 100 % 10’ c/u.
2 cambios de alcohol 96 % 10’ c/u.
Agua desionizada 1’ agitando.
-Desenmascaramiento:
Calentar 5’ a 95ºC en buffer citrato de sodio 10 mM (pH: 6,0). Descartar el buffer.
Calentar 5’ a 95ºC en buffer citrato de sodio 10 mM (pH: 6,0). Dejar enfriar durante 20’.
Lavar 3 veces con agua desionizada 2’ c/u agitando.
Aspirar el exceso de líquido.
-Bloqueo de la peroxidasa endógena:
Incubar los especímenes con agua oxigenada al 1 o 3 % en PBS durante 10’ a 15’.
Enjuagar con PBS.
Lavar 2 veces con PBS 2’ c/u agitando.
Aspirar el exceso de líquido.
-Bloqueo de sitios inespecíficos (hidrofóbicos):
Suero bloqueante: albúmina de suero bovino al 1,5 o 3 % en PBS. Se recomienda prepararlo en los
primeros pasos del protocolo.
Incubar los especimenes 30’ con suero bloqueante.
Aspirar el exceso de líquido.
-Anticuerpo primario:
Incubar los especímenes con anticuerpo primario toda la noche en heladera, o bien 2 horas a
temperatura ambiente. El anticuerpo debe ser diluido en suero bloqueante.
Enjuagar con PBS
Lavar con PBS 2 veces agitando 2’ c/u.
Aspirar el exceso de líquido.
-Sistema de detección:
-a)Anticuerpo secundario biotinilado:
Incubar los especímenes 10 a 30’ con Anticuerpo secundario biotinilado.
Enjuagar con PBS
Lavar con PBS 2 veces agitando 2’ c/u.
Aspirar el exceso de líquido.
-b)Complejo Streptavidina-peroxidasa (Strep-HRP):
Incubar los especímenes 10 a 30’ con Streptavidina-peroxidasa.
Enjuagar con PBS
Lavar con PBS 2 veces agitando 2’ c/u.
Aspirar el exceso de líquido.
Durante este paso preparar el sustrato de HRP:
5 mg de diaminobencidina (DAB) en 10 ml de PBS. En el momento de usar agregar 20 μl de agua
oxigenada.
-Revelado:
Incubar con el sustrato HRP 30’’ a 20’ hasta que la coloración del espécimen sea marrón clara (paso
crítico). Cortar con agua desionizada.
Enjuagar con agua desionizada.
Lavar con agua desionizada 2 veces agitando 2’ c/u.
-Contracoloración:
Contracolorear con hematoxilina 15 a 30’’ (si es nueva) o 60’’ (si es usada)
Lavar con varios cambios de agua desionizada.
-Decoloración:
Decolorar 10’’ con alcohol ácido (49,5 ml alcohol 70% + 0,5 ml HCl 1N).
Lavar varias veces con agua corriente. Dejar con agua corriente hasta virar el colorante
aproximadamente 5’.
-Deshidratación:
2 cambios de alcohol 96 % 10’’ c/u.
2 cambios de alcohol 100 % 10’’ c/u.
3 cambios de xilol 10’’ c/u.
-Montar con bálsamo de Canadá natural
Recordar:
Si se trabaja con anticuerpos monoclonales utilizar PB en lugar de PBS.
ERRORES Y PROBLEMAS EN LAS TECNICAS DE INMUNOMARCACION
I) Sobremarcación. El problema del background (Coloración de fondo
inespecífica).
a) Errores de la fijación.
 Posible difusión de antígenos solubles.
 Fenómenos de autólisis.
 Algunos tejidos no fijados o mal fijados.
 Excesiva fijación con formalina.
b) Errores en los procesos posteriores.
 Los alcoholes en general no alteran la marcación.
 No utilizar el acetato de butilo como aclarante pues produce un background
importante.
 No renovar los solventes.
c) Errores en la inclusión.
Utilizar parafina de bajo punto de fusión. No es recomendable usar celoidina
En general el background está en relación directa con el tiempo y la
temperatura de inclusión.
d) Errores en el corte.
-Corte de tejido demasiados gruesos.
-La porción cortada contiene efectos de aplastamiento.
e) Errores en el colado.
 Se recomienda trabajar con portas nuevos y lavados con solución alcoholácida.
 No utilizar albúmina de huevo (Albúmina de Meyer).
 No utilizar adhesivo en exceso o aplicado irregularmente sobre los portas.
 Se recomienda derretir la parafina colocando los cortes montados en estufa
de 56ºC durante 24 hs.
 Precaución si el tejido se despegó parcialmente.
f) Errores en la eliminación de la parafina.
La remoción incompleta del medio de inclusión provoca una tinción de fondo
limitada a áreas del tejido.
g) Errores en las incubaciones.
 Coloración de fondo debido a interacciones hidrofóbicas
 Coloración de fondo producida por interacciones iónicas
 Un mal bloqueo de la peroxidasa endógena
 Actividad endógena ligadora de (Strepta)avidina
 Incubación con el Ac 1rio
 Receptores Fc.
 Reactividad cruzada.
h) Errores en los lavados.
i) Errores del revelado.
Tiempo excesivo de revelado.
j) Errores en el contraste.
Tiempo excesivo en el contraste.
k) Fuentes misceláneas.
La coloración difusa de todos o de la mayoría de los elementos del tejido
dentro de un área, puede ser causada por lesión física al tejido o porque tejido
se secó antes de la fijación o durante el proceso de IHQ.
II) Submarcación.
a) Errores en la fijación e inclusión.
Esto es debido fundamentalmente a la destrucción o enmascaramiento del
antígeno por un tratamiento indebido o el uso de un reactivo inadecuado.
b) Cortes demasiados finos.
c) Errores en las incubaciones.
 Se recomienda la no reutilización de los buffer.
 Utilización de buffer salinos con Anticuerpos monoclonales.
 Bloqueo excesivo de la peroxidasa endógena.
 En algunos casos utilizar Tritón X 100 al 0,1-0,4 %.
 Mala conservación de los anticuerpos.
 Errores en las incubación con los anticuerpos.
 Exceso de reactivo que queda en el corte de tejido.
d) Errores en los lavados.
e)Errores del revelado.
Esto es debido a tiempos cortos de revelado o la mala composición de la
solución reveladora.
f)Fuentes misceláneas.
Se debe evitar el uso de azida sódica en diluyentes y buffer.
Inmunohistoquímica aplicada a extendidos citológicos
Recomendaciones:
•Fijación inmediata
•Usar portas silanizados o con carga positiva
•Los extendidos finos en monocapa
•Aplicar técnica de rehidratación (si son muestras hemáticas)
•Fijadores: alcohol 96º (extendidos), metanol frío o acetona fría (cultivos
celulares)
•No realizar digestión enzimática como método de recuperación
antigénica
•Recuperación con calor a menor temperatura y menor tiempo. Se puede
agregar una pequeña cantidad de detergente a la solución recuperadora
•Tratamiento con cloroformo para ciertos antígenos de membrana
•Mayor bloqueo de peroxidasa endógena
•Bloqueo de biotina (si se utiliza biotina-avidina)
•El contraste nuclear se hará con mayor tiempo de coloración y virado
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