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Introdução à morfologia e função nuclear

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Introdução à morfologia e função nuclear
REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet
2011 Volumen 12 Nº 8 - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080811.html
REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504
Introdução à morfologia e função nuclear (Introduction
to nuclear morphology and function)
Dias Correia; J. H. R. : CIISA, Departamento de Morfologia e
Função, Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa, Avenida
da Universidade Técnica, Pólo Universitário, Alto da Ajuda,
1300-477, Lisboa, Portugal email: [email protected] │
Dias Correia, A. A.: Professor jubilado de Faculdade de
Medicina Veterinária de Lisboa, Avenida
da Universidade
Técnica, Pólo Universitário, Alto da Ajuda , 1300-477, Lisboa,
Portugal.
Resumo
O núcleo das células dos mamíferos é um organelo compartimentado
quanto a espaço e funcionamento, contendo numerosos corpos
nucleares proteinaceos assim como domínios do genoma, não
colocados ao acaso no seu interior, ao contrário do que se pensava
inicialmente de que seria destituído de organização interior.
Estes compartimentos são desprovidos de biomembranas e possuem
um conjunto de proteínas diferentes consoante o compartimento.
O núcleo celular é um organelo altamente dinâmico havendo situações
em que se realiza independentemente da utilização de energia ao
contrario de outras.
A zona periférica do núcleo adjacente ao invólucro nuclear é a zona
onde parece ocorrer a activação e repressão dos genes dos
cromossomas.
No invólucro nuclear é considerada a membrana nuclear externa, a
membrana nuclear interna, a lamina nuclear, e os complexos poros.
As membranas nucleares e a lamina nuclear interactuam entre si
através de diversas proteínas, algumas integrais da membrana nuclear
interna, outras associadas com as laminas nucleares e com a proteínas
do nucleoplasma dentro da matriz nuclear. A matriz nuclear com
grandes quantidades de RNP (ribonucleoproteinas) interactua com
determinadas zonas do DNA dos cromossomas. São revistas algumas
interações entre estes variadíssimos tipos moleculares, inclusive com o
citoesqueleto celular.
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Também
suborganelos
subnucleares
contribuem
para
as
movimentações intranucleares, gerando-se provavelmente gradientes
de pH intranucleares envolvidos em toda a dinâmica celular.
Palavras chave :núcleo, organelos sub-nucleares, nucleoplasma,
nucleoesqueleto,
compartimentos
nucleares,
corpos
nucleares
proteinaceos, invólucro, lamina, matriz, laminopatias
Summary
The nuclei belonging to cells from mammals have been organells
divided in different compartments as far as space and functioning have
been concerned. They contain several proteinaceous nuclear bodies as
well as genome’s domains that have not been organized randomly
inside the nuclei. This view has been in opposition to the initial trought
that the nucleus was devoid of internal structure.
The compartments in the nucleus are free from membranes and show
different array of proteins in separate compartments.
The nucleus has been a highly dynamic organell and its dynamics and
has in some circumstances been independent of energy consumptiom,
but in other circunstances energy expenditure has been implied.
The periphery of a nucleus (close to the nuclear envelope) has been
the area where it has looked like that the activation and the repression
of genes take place.
In the nucleus’ envelope one must consider the external nuclear
membrane, the internal nuclear membrane, the nuclear lamina and the
pores complex.
There has been an interaction between the nuclear membranes and the
nucleus’ lamina, the interaction being mediated by several proteins.
Some of these proteins have been the nucleus’ inner membrane
integral proteins, some others have been associated with the nuclear
lamina and the proteins of the nucleoplasm inside the nucleus’ matrix.
The nuclear matrix, holding large amounts of riboonucleoproteins
(RNP) interacts with DNA in cromossomes, In this paper the two
authors review these varied molecular types including their interaction
with the cell’s cytoskeleton.
Subnuclear organells make their contribution towards movement of
partcles inside the nucleus probably becoming responsible of the pH
gradients inside the nucleus that, in the other hand, have possibly
been involved in the whole cellular dynamics.
Keywords:
nucleus,
subnuclear
organelles,
nucleoplasm,
nucleoskeleton
nuclear
compartments,
proteinaceos
nuclear
bodies,envelope, lamina, matrix, laminopthies
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1-Introdução à morfologia e função nuclear.
1.1-Introdução
Sumula global da arquitectura nuclear (Misteli, T. 2005).
O nucleo das células dos mamiferos é um organelo compartimentado
quanto a espaço e funcionamento, contendo numerosos corpos
nucleares proteinaceos assim como domínios do genoma, não
colocados ao acaso no seu interior.
As mudanças da arquitectura nuclear são fundamentais durante os
processos de desenvolvimento e diferenciação celular. O estudo
intenso da arquitectura nuclear levou à criação de diversos conceitos
gerais através dos quais se tem criado alguma compreensão acerca do
funcionamento nuclear.Assim Mistell ,T. (2005) desenvolve para este
efeito uma serie de conceitos que se referem seguidamente:
•
•
•
•
•
•
•
1º O conceito dos compartimentos nucleares onde há que
considerar os corpos nucleares proteinaceos e os domínios de
cromatina.
2º O conceito dos territórios ocupados pelos cromosomas.
3º O conceito da organização nuclear não ao acaso onde se
desenvolvem os genomas em três dimensões e o posicionamento
dos corpos nucleares.
4º O conceito da dinâmica nuclear.
5º O conceito de “scaffolds” nucleares.
6º O conceito da própria organização do núcleo.
7º O conceito das doenças nucleares.
Segundo Mistelil dadas as dificuldades de definir um “esqueleto”
estático para o núcleo, e, por outro lado , dado o elevado dinamismo
da arquitectura do núcleo, têm ocorrido sugestões que vão no sentido
de que o núcleo é uma entidade que se organiza a si própria.
No núcleo das células dos mamíferos sabe-se hoje que existe um
número crescente de suborganitos no seu interior, (ao contrário do que
se pensava inicialmente de que seria destituído de organização
interior) compartimentos ou corpos nucleares ou sejam domínios
especializados (Spector, D.L., 2001).
A expressão dominio no contexto cientifico pode ter diversas
conotações, independentemente da clássica utilização na classificação
biológica.
Assim por analogia e noutros contextos, conjuntos complexos de
variadíssimas moléculas biológicas no núcleo podem constituir
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simplesmente o que se considera serem domínios nucleares, dadas as
suas características funcionais.
Já quanto aos domínios proteicos estes são considerados como uma
parte da sequência da proteína e da sua estrutura que pode
transformar-se, funcionar e existir independentemente do resto da
cadeia da proteína.
Neste caso cada domínio forma uma estrutura tridimensional compacta
que pode conter de 25 a 500 ácidos aminados de comprimento.
Diversas proteínas podem possuir diversos domínios estruturais.
Por outro lado, na organização global dos genomas, os domínios da
cromatina ( a cromatina é uma combinação de DNA, histonas e outras
proteínas que constituem os cromossomas) podem conter genes
vizinhos que podem ser “arrumados” juntos em estruturas
cromatínicas específicas que asseguram a sua expressão coordenada (
domínios cromatinicos).
Cada dominio cromaíinico pode incluir dezenas de genes
com funções similares.
por vezes
Os domínios cromatinicos são estruturalmente distintos e representam
unidades reguladoras para a expressão dos genes e comportamentos
dos cromossomas.
Os domínios cromatinicos são muitas vezes definidos através de
conjuntos distintos de histonas modificadas após a sua tradução.
O estabelecimento de distintos domínios é muitas vezes realizado
através destas modificações proteicas das histonas, após a sua
tradução
A organização do núcleo das células eucariotas dos animais superiores
constitui um elemento chave para o funcionamento do genoma.
Este núcleo encontra-se funcionalmente compartimentado como
referimos em suborganitos contendo cada um deles numerosos corpos
nucleares proteinaceos, assim como domínios , não posicionados de
qualquer maneira mas sim numa determinada organização espacial e
temporal.
Mudanças na arquitectura nuclear decorrem durante os processos de
desenvolvimento e diferenciação celular , sendo conhecido que
deficiências nesta arquitectura nuclear podem ser a causa de diversas
doenças já conhecidas nos seres humanos e ratos ( Mus musculus).
Dentro das doenças nucleares identificadas em seres humanos e em
ratinhos experimentais, que são já numerosas, as laminopatias
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causadas por mutações nas proteínas lâminas A e C codificadas pelo
gene LMNA originam distrofias musculares, lipodistrofias, neuropatias e
outras doenças, em consequência de defeitos mecânicos originados na
lâmina nuclear, ou de mutações.
Um compartimento nuclear é pois uma região morfologicamente e
funcionalmente distinta, dentro do núcleo.
Estes compartimentos são desprovidos de biomembranas e possuem
um conjunto de proteínas diferentes consoante o compartimento.
Assim, como veremos adiante, o nucléolo encerra actividades de
transcrição e processamento dos rRNA, os compartimentos com
factores de “splicing” encerram componentes spliceossomais, os corpos
de Cajal são locais de montagem de snRNP (pequenas
ribonucleoproteinas) e os corpos PML tem funções um tanto
desconhecidas.
Um corpo nuclear é pois um local com actividades particulares.
Estes compartimentos nucleares desprovidos de biomembranas
parecem resultar mais de interacções transitórias e não específicas
entre as proteínas neles residentes,mais do que da presença de um
“scaffold” estável.
O conceito da existência de “scaffolds” nucleares não tem tido suporte
experimental, embora se possa admitir que as proteínas lâmínas
(lamins) A, B e C do tipo filamentos intermediários, que são bem
conhecidos, possam formar uma rede, a lâmina nuclear, revestindo
internamente o invólucro nuclear excepto ao nível dos poros.
Nas células dos animais o respectivo núcleo é o habitat natural do
genoma onde cada cromossoma parece ocupar um determinado
espaço (território) o que parece apontar para o seu desenvolvimento na
regulação do funcionamento dos genes e na estabilidade do genoma, quer no
estado hÍgido, quer em situações anormais (Meaburn, K.J. e Mistel, 2007).
Nas células eucariotas o núcleo desempenha uma série de processos separados
no tempo e no espaço de todos os outros componentes e compartimentos
celulares (Rzepeck, 2002).
Nesses processos ocorridos no núcleo incluem-se a replicação, a transcrição, o
processamento do RNA e a montagem das subunidades ribossomais, enquanto
a maioria das biossínteses proteicas decorre no citoplasma celular, implicando o
transporte posterior de muitas proteínas para o núcleo da célula.
Os domínios da cromatina são morfologicamente definidos em regiões
genómicas menos condensadas (eucromatina) ou altamente condensadas
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(heterocromatina), as primeiras activas para a transcrição e as segundas ricas
em regiões inactivas e silenciadas, o que parece ser uma perspectiva um tanto
superficial.
Ambas estas cromatinas ( eu ou hetero) têm modificações nas sua histonas que
ocorrem após a tradução destas, como veremos adiante, as eucromatinas ricas
em histonas H3 e H4 hiperacetiladas e as heterocromatinas com hipoacetilação
e trimetilação da histona H3 na lisina 9.
Os cromossomas existem ocupando especialmente determinados territórios nos
núcleos.
A estrutura interna dos cromossomas é ainda um tanto ambígua, admitindo-se
em princípio que os genes activos transcriptionalmente se situam à superfície do
cromossoma havendo como que canais entre os diversos territórios de cada
cromossoma em ordem a facultar a circulação de factores reguladores.
Mesmo a cromatina em interfase é dinâmica, com porções dessa cromatina
cromossomal
desenrolando-se
ou
enrolando-se
(eucromatina
↔
heterocromatina) em ordem a emitir para a sua superfície ansas dessa
estruturas aptas a serem transcritas ou silenciadas.
Durante a interfase a maioria da heterocromatina da maior parte dos
cromossomas situa-se na periferia do núcleo com uma pequena parte à volta do
nucleólo ou difundindo-se no nucleoplasma e provavelmente ligada ao invólucro
nuclear, enquanto a eucromatina se distribui mais para o interior do núcleo
através de múltiplas ansas.
Durante a mitose as clássicas bandas claras e escuras dos cromossomas
alternam, com a cromatina das bandas escuras (heterocromatina) a replicar-se
tardiamente na fase S e com as bandas claras (eucromatina) a replicar-se no
início da fase S.
No núcleo nos espaços que se situam entre a cromatina encontram-se
complexos proteicos e ribonucleoproteícos (snRNP) envolvidos no metabolismo
do RNA e noutros metabolismos.
A acumulação de diversos factores nucleares nestes compartimentos produz
uma elevada concentração desses factores nesses locais favorecendo certo tipo
de reacções (Lamond & Sleeman, 2003).
De tudo isto ressalta, repete-se, que a organização nuclear não é ao acaso, e os
cromossomas ricos em genes parecem posicionar-se sobretudo no centro do
núcleo, enquanto os pobres em genes se situariam na periferia deste núcleo.
A posição relativa de uns cromossomas em relação aos outros parece ser
específica de cada tecido (Boyle et, al.; Parada et, al.;Cremer et, al., citados em
Misteli, T. 2005), mas os mecanismos que estão na base deste comportamento
são desconhecidos.
Os loci dos genes dos diversos cromossomas também não ocupam uma
distribuição ao acaso, mas ignora-se quais as razões destes comportamentos.
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O núcleo celular é pois um organelo altamente dinâmico e este dinamismo é
complexo havendo situações em que se realiza independentemente da utilização
da energia ao contrário de outras.
As proteínas e os seus complexos exibem “in vivo” movimentos dinâmicos, tal
como os corpos nucleares, embora o nucléolo seja, quanto à sua posição,
relativamente estável, pelo menos durante curtos períodos de tempo, mas a
maioria dos outros componentes nucleares são dinâmicos no seu
posicionamento, sendo sensíveis às taxas de ATP, para este efeito.
As proteínas podem circular rapidamente no espaço nuclear permutando
componentes entre os diversos compartimentos tais como com a cromatina, os
cromossomas e os corpos nucleares, bem como com o citoplasma celular e nos
dois sentidos (de saída e de entrada de moléculas) através de sinais residentes
nessas variadíssimas moléculas e de transportadores e receptores adequados
(Carmo-Fonseca, M. 2000).
Também os loci dos genes têm movimentações dinâmicas.
Repete-se que nos compartimentos do núcleo há que considerar além dos
cromossomas, uma série de corpos nucleares no nucleoplasma, onde se incluem
os nucléolos, corpos de Cajal, “Gems”, “splicing speckles”, corpos PML
(promielocitic leucemia) e outros pior conhecidos (Lamond & Sleeman, 2003),
(vide Figura 1 seguinte)
É hoje conhecido, como temos referido, que os genes e os cromossomas não se
encontram posicionados ao acaso dentro do núcleo, sendo este posicionamento
finamente regulado por mecanismos por ora desconhecidos.
Esta compartimentação no núcleo das células dos animais superiores contribui
em certa medida para o distinto funcionamento do respectivo genoma (Misteli, T.,
2004) em função dos diversos graus de organização da cromatina (com graus de
condensação muito diferentes, heterocromatina e eucromatina) e dos diversos
subcompartimentos proteinaceos nucleares desprovidos de membrana, como é o
caso dos nucléolos e de uma diversidade de pequenos corpos no interior desses
núcleos. Os próprios cromossomas e a distribuição do material genético em cada
cromossoma parecem ocupar territórios próprios dentro do espaço nuclear
ocupando posições preferenciais em relação ao centro do núcleo e em relação
com os diversos outros cromossomas.
As propriedades de cada gene em cada cromossoma estarão dependentes da
sua posição relativa em relação com o invólucro nuclear e com os vários
domínios cromatínicos bem como com os diversos compartimentos proteináceos
contidos no interior do núcleo.
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Figura 1
Principais componentes do nucleo
Poro nuclear
Domínios
manchas
speckles
Nucleolos
Espaço
intercromatina
Corpo
PML
cromatina
cromossomatica
a
Território
cromossomico
Corpo de
Cajal
heterocromatina
Eucromatina
descondensada
Heterocromatina
condensada
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Estrutura de cromatina
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A activação e a repressão dos genes dos cromossomas na periferia do núcleo
podem ser sparados ao longo do tempo.
Esta regulação ao nível da periferia do núcleo pode ser obtida através da
formação de ansas de cromatina contendo loci activos, ansas essas ancoradas
através dos compostos NPC (complexos proteicos dos poros) e ficando assim
disponíveis para interactuar com activadores de transcrição.
No desenho seguinte as regiões de cromatina reprimida enconytam-se na
heterocromatina na periferia condensada.
A periferia pode conter domínios activados e reprimidos consoante a presença
de activadores ou repressores.( Figuras 2 A e 2 B)
Figura 2a
Separação ao nível da periferia nuclear entre a activação e a repressão da cromatina
Domínio repressivo
N
P
C
Periferia nucleica
Domínio em activação
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Figura 2b
Evolução ao nível da periferia nuclear entre a activação e a repressão
Ansas de heterocromatina reprimida
N
P
C
Docagem
das ansas aos
poros nucleares
Factores de
transcrição
activação
Ansas de eucromatina activa
A zona periférica do núcleo adjacente ao invólucro nuclear assume
particular relevo dentro deste âmbito pois é a zona onde parece
decorrer a repressão da transcrição e onde se encontram grandes
blocos de heterocromatina condensada reprimida, parecendo que
quando da sua activação esses genes seriam reposicionados mais para
o interior do núcleo.
Parece pois que a periferia nuclear seria um ambiente favorecedor da
repressão da transcrição dos genes cromossomais.
1.2 – Invólucro nuclear
Nas células eucariotas as actividades nucleoplásmicas (no interior do
núcleo) e citoplásmicas (no citosol) são separadas pelo invólucro
nuclear.
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O invólucro nuclear é uma estrutura com uma dupla membrana, em
que a membrana ou folheto externo é contiguo com o retículo
endoplásmico rugoso citoplásmico por vezes com ribossomas.
Este folheto membranário mais externo (ONM) de membrana nuclear é
funcionalmente semelhante ás membranas do retículo endoplásmico
(ER) sendo separado do folheto membranário mais interno (INM) ou
membrana nuclear interna pelo espaço perinuclear.
Estes dois folhetos ou membranas cada um deles com uma dupla
camada lipídica são funcionalmente e estruturalmente diferentes.
Em certas zonas as duas membranas, do invólucro nuclear, fundem-se
para originar os poros nucleares (NPC) compostos por cerca de 30
proteinas diferentes ( nucleoporinas), através das quais se faz o
trânsito entre o núcleo e o citoplasma por mecanismos razoavelmente
conhecidos.
Por dentro do invólucro nuclear liga-se a lâmina nuclear periférica
composta por lamínas (lamins) A/C e B que parecem regular a
estrutura do invólucro nuclear e servirem de ancoradouro da cromatina
à periferia do núcleo durante a interfase.
No invólucro nuclear há pois que considerar a membrana nuclear
externa, a membrana nuclear interna, a lâmina nuclear fibrosa e os
complexos poros nucleares (NPC na figura anterior).
1.3 – Lâmina nuclear. Lamínas. Matriz
A lâmína nuclear é uma estrutura fibrosa ( que faz parte da matriz
nuclear) composta por cerca de cinco proteínas ( lamíns) A, B, C, D e E
relativamente análogas aos filamentos intermediários.
Recorda-se que o citoesqueleto das células eucariotas (também
envolvido no transporte de vesículas pelas células) é uma estrutura
dinâmica formada de três classes de conjuntos filamentosos montados,
os microfilamentos, os filamentos intermediários e os microtúbulos.
Os filamentos intermediários ( de 7 a 11 nm de diâmetro) contêm
conjuntos de 2 ou 3 cadeias helicoidais alfa “enroladas” entre si ( two
or three-stranded α helical coiled-coil cores) flanqueadas por diversas
sequências de cada lado.
Estudos de clonagem e sequenciação do cDNA das laminas ( Goldman,
R.D. et al.2002) confirmaram que as lamins têm um domínio com
estrutura típica como a dos filamentos intermediários inclusive
domínios α-helical coiled-coil flanqueado por domínios não helicoidais.
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As lamins estão implicadas numa série de funções inclusive o
montagem do invólucro nuclear, a síntese do DNA, a transcrição e a
apoptose.
Os genomas de diversos mamíferos revelam três genes para as lamins
( LMNA, LMNB 1 e LMNB2) codifricando sete isoformas spliced
alternadamente. O tipo-A lamins A, A▲10, C e C2 são todos derivados
do gene LMNA. O tipo-B lamins são B1 codificados pelo LMNB1 e B2-B3
codificado pelo LMNB 2.
Além da lâmina periférica, há provas evidentes de que as lamins
também se formam e existem no interior da estrutura nucleoplásmicas
quer originando-se aqui em flocos distintos, ou como que constituindo
um véu que preenche o nucleoplasma.
Há diversas proteínas que interactuam com as lamins ( Cohen et al.
2001 in Goldman R. D. et al, 2002) e que podem ser distribuídas em
dois grupos.
O 1º grupo consiste de proteínas integrais da membrana nuclear
interna ( Vide adiante) onde se incluem diversas isoformas da proteína
2 associada com lamin ( LAP2), LAP1, emerina, MAN1, otefin, receptor
da lamin B (LBR), nurin , nesprin , RING finger-binding protein (RFBP),
A-kinase-anchoring protein 149 (AKAP 149), p18 e provavelmente
UNC-84.
O 2º grupo contem proteínas que não são componentes integrais de
membrana, mas que se encontram sobretudo na região da lãmina
nuclear como por exemplo GCL, YA (young arrest), PP1 fosfatase e o
factor de transcrição Oct 1.
Durante a interfase, as lamins nucleares são continuamente sitetizadas
e incorporadas na lamina.
O envolvimento das lamins na síntese do DNA está assinalado
parecendo que a replicação do DNA necessita de uma organização
normal das lamins, parecendo haver um papel directo das lamins na
síntese do DNA:
Há sugestões de que os locais em que regiões da cromatina parecem
ancoradas nas lamins estariam envolvidas na regulação da actividade
da transcrição, embora se ignore como.
As lamins podem interactuar com as sequências MARs e SARs do DNA
(vide adiante).
A expressão matriz nuclear não é um conceito, mas sim uma estrutura
celular observável.
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A designação matriz nuclear corresponde a uma estrutura residual do
núcleo após este ter sido extraído por solventes variados.
Globalmente, na arquitectura do núcleo estão envolvidas estruturas
sobrepostas digamos assim, e contendo ácidos nucleicos e que são a
cromatina e a matriz nuclear.
As estruturas não cromatinicas do núcleo após estudos de microscopia
electrónica passaram a ser designados como constituindo a matriz
nuclear.
Apesar de estarem identificadas diversas proteínas da matriz nuclear,
por enquanto não conhecemos como elas interactuam entre si para
formar fibras, filamentos de 10 nm e como ocorre a montagem desta
estruturas ou seja a arquitectura interior do núcleo(nucleoesqueleto)
Estes complexos de fibras são feitos sobre “andaimes” de filamentos
ramificados de 10 nm que se ligam com a lâmina nuclear. A
ultraestrutura da matriz nuclear consiste da lâmina nuclear e de uma
rede nuclear interna de subassociações ligadas entre si por fibras
altamente estruturadas.
A matriz nuclear possui na sua estrutura e composição, em grande
parte, uma rede de ribonucleoproteínas ( RNP).
Já há cerca de 30 anos se verificou que esta estrutura RNP constituída
por RNA associado com proteínas, estava ligado a uma estrutura não
cromatinica intranuclear.
Hoje está esclarecido por T Cech e tal. que snRNP (small nucleic
ribonucleoproteins) com cerca de 150 nucleótidos de comprimento são
complexos de RNA proteínas que se combinam com pré-mRNA não
modificado e várias outras proteínas para formar um “ spliceossoma”
essencial para a remoção de intrões do pré-mRNA, uma modificação
post-transcrição critica no núcleo das células eucariotas,
As RNP e os RNA organizados com proteínas, estão ligados a uma
estrutura intranuclear não cromatínica, sabendo-se por outro lado que
as ligações periódicas e especificas das fibras de cromatina à matriz
nuclear criam ou formam as ansas de cromatina ( loop domains).
O núcleo é um organito dinâmico, cujas estruturas intranucleares, tais
como a cromatina ou subassemblagem da matriz nuclear, se
movimentam lentamente enquanto as suas moléculas constituintes se
encontram num equilíbrio mais rápido com os “pools” nucleoplásmicos.
As estruturas não cromatinicas do núcleo foram primeiramente
observadas em secções fixadas dos tecidos e nesta forma, estas
estruturas eram ambas estáticas e paradas.
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A lâmína nuclear reveste o lado nucleoplásmico do folheto
membranário interno, e essa lâmina tem uma composição química que
varia consoante o tipo celular e o seu estádio de diferenciação sendo as
lâmínas o seu principal componente proteico.
Por outro lado, como temos vindo a referir, além deste esqueleto
periférico as proteínas lâmínas podem formar outras estruturas mais
para o interior do núcleo.
Associadas com as proteínas lamínas da lâmina nuclear encontram-se
outras proteínas, a maioria das quais são proteínas integrais do folheto
interno membranário (INM) onde existem, nos mamíferos, mais de 78
destas proteínas integrais (Margalit et, al. 2005).
Estas proteínas membranárias integrais do invólucro nuclear
interactuam com as proteínas Lamínas e regulam assim uma enorme
variedade de interacções entre as membranas nucleares, a lamina
nuclear, a cromatina e o DNA conforme se esquematiza em figura
adiante.
A lâmina nuclear é pois uma rede fibrosa anastomozada, ligando a
superfície do nucleoplasma com a membrana nuclear interna, servindo
para ligação da cromatina, ancoragem de filamentos intermediários
citoplásmicos ao núcleo e estabilização da membrana nuclear
(Georgatos, S.P. et, al., 1988).
Resumindo, a membrana interna do invólucro nuclear liga-se portanto
do lado do nucleoplasma a uma outra camada de finos filamentos que
se distribuem à volta do núcleo excepto nos poros, constituindo a
lâmina nuclear, servindo esses finos filamentos como estabilizantes,
havendo sugestões acerca da sua semelhança com os filamentos
delgados do citoesqueleto citoplásmico das células.
Nas células dos mamíferos a lâmina é composta por mais 5 isotipos de
lamínas (3 tipos da A e 2 tipos da B)
As lâminas do tipo A e do tipo B são pois proteínas helicoidais
filamentosas da lâmina nuclear e do nucleoplasma.
As lâminas do tipo A encontram-se no interior do nucleoplasma e as
laminas do tipo B estão próximas da membrana nuclear interna
podendo ligar-se a proteínas integrais que se encontram embutidas
nesta membrana nuclear interna.
As lâminas estão implicadas na organização e funcionamento do
núcleo. Antes e depois da mitose organizam-se e desorganizam-se
através de fosfatações que convertem o invólucro em vesículas
14
Introdução à morfologia e função nuclear
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enquanto a
membrana.
desfosfatação
reverte
este
efeito
reconstruindo
a
Defeitos associados com os genes codificadores das lâminas estão
implicados numa série de patologias associadas, como é o caso das
laminopatias (Mounkes e Stewart, 2004 citados em Jackson, D, 2005).
As lamínas estão reconhecidas como tendo um papel directo na síntese
do DNA, não se conhecendo o seu funcionamento específico durante a
transcrição (Goldman, R. D. et, al., 2002) mas qualquer um destes
processos resulta das interacções das lâmínas e outras proteínas
associadas com a cromatina, havendo provas de que sequências MARs
do DNA (matrix – attachement regions) e SARs (scaffold – attachment
regions) interactuarem com as lâmínas (Goldman, R.D el at..2002).
O “Scaffold” nuclear ou matriz nuclear como já referimos
são
estruturas proteinaceas que ficam após a extracção da membrana
nuclear e das histonas e nele parece residir sobretudo uma proteína de
170.000 MW identificada como topoisomerase II, o que é no entanto
contestado (Tsutsui, K. et, al. 1993).
Nos cromossomas em metáfase também se refere um “Scaffold” do
cromossoma como sendo uma estrutura contìnua revelada em
cromossomas isolados na metáfase e após extracção severa.
Também se refere que as topoisomerases se encontrariam nas ansas
(“loop”) do DNA com uma frequência de três cópias de Top.II por cada
70 Kb de DNA. No DNA existiriam sequências dispersas que
interactuariam especificamente com o “scaffold” nuclear.
A associação do DNA nuclear com a matriz nuclear (scaffold) é pois
realizada através de segmentos definidos do DNA, segmentos esses
denominados MAR ( região de associação com a matriz ) ou SAR
(região de interacção com o scaffold) (Tsutsui,K. et, al. 1993).
Estas regiões de ligação da matriz nuclear como DNA (MAR) seriam as
responsáveis pela organização da cromatina em domínios em ansas
(loop).
Os MARs são habitualmente encontrados em regiões não transcritas
ricas em A-T (>70%) e têm cerca de 300-1000 bp de comprimento.
Segmentos de DNA, MAR ou SAR têm sido identificados em diversas
regiões dos genes. A coexistência ou justaposição de MAR/SAR com
promotores/”enhancers” da transcrição e com origens de replicação
está assinalada (Cockeril e Gamand; Gasser e Laemeli; Amati e
Gasser;;DijKwell e Hamlim, citados em Tsutsui, et,al. 1993).
Alguns pontos de cisão dos cromossomas também coincidem com a
existência de MAR (Sperry et, al. citados em Tsutsui et, al. 1993).
15
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Parece pois que o MAR está envolvido na organização em ansas do
DNA nuclear, uma consequência directa da sua ligação com a matriz
nuclear.
Noutras proteínas referidas como envolvidas na ancoragem do DNA
nuclear ao “scaffold” através dos segmentos MAR estão assinaladas por
exemplo a proteína SP120, e a proteína ARBP e ainda a DNA
topoisomerase II. Em relação à topoisomerase II há no entanto
opiniões contraditórias sobre a sua preponderância.
Quadro resumo das características das regiões
MARs de
interacção com a matriz nuclear ( Adaptado de Microsoft power
point- Lecture 10- 2004).
1. São sequências dispersas no DNA do genoma, que interactuam
especificamente com o “ scaffold” nuclear.
2. As matrizes de uma espécie são capazes de inter actuar com
MARs de outras espécies
3. A homologia entre os MARs não é suficiente para permitir a
hibridação cruzada.
4. Estão envolvidas na organização da cromatina em domínios em
ansas.
5. Estão envolvidas na replicação do DNA e na expressão dos seus
genes
6. O “scaffold” encontra-se por vezes apenas nos cromossomas em
metáfase.
7. Os segmentos MAR cingem-se muitas vazes a locais específicos
do DNA ricos em A-T (+ 70%) mas esta riqueza em A-T apenas,
não é suficiente para a interação com a matriz.
8. Os MARs são mais frequentes em regiões do DNA não
transcritas.
9. Os MARs tem habitualmente um comprimento de 300-1000bp.
1.4 – Interacções membrana nuclear interna – Lâmina nuclear
– nucleoplasma.
A Lâmina nuclear e o folheto interno membranário (INM) do invólucro
nuclear constituem como que um esqueleto de filamentos proteicos à
volta da periferia do núcleo.
Na constituição deste esqueleto encontram-se sobretudo proteínas
filamentosas intermediárias do tipo V ou sejam laminas A/C e B que
formam uma rede complexa no interior da INM (Foisner, R., 2001).
As lâminas do tipo B são essenciais para o desenvolvimento e são
expressas ubiquamente, enquanto as do tipo A não são essenciais e
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exprimem-se apenas em células diferenciadas sendo necessárias para
manter a integridade de músculos e tecido adiposo.
As lamíns são estruturas “coiled-coil) com uma pequena cabeça Nterminal seguida por um domínio em bastão (rod-coiled coil) e uma
cauda globular C-terminal .
Através destas regiões “coiled coil” das laminas elas podem formar
dímeros paralelos e depois a partir destes dímeros originarem
tetradas (anti-paralelas) e polímeros anti-paralelos (cabeças com
caudas). (Figura 3)
O aspecto estrutural mais notório das lamins A, B e C consiste numa
região α-helicoidal de heptadas repetidas de ácidos aminados.
A lamin A é gerada a partir da prelamin A, em quatro etapas pos
tradução: farnesilação, libertação endoproteolitica dos últimos três
ácidos aminados da proteína, metilação da farnesil-vcisteína Cterminal e finalmente libertação endoproteolítica dos últimos quinze
ácidos aminados da proteína (incluindo o Ester metilfarnesilcisteína.
Este esquema de processamento é crucial para a adesão da lamin A
ao invólucro nuclear ( Coffinier, e tal. 2010)
No Gallus gallus a lamin A apresenta 653 acidos aminados de
comprimento contendo oito regiões em toda a sua extensão,
ocupando as seguintes posições cada uma delas e com o respectivo
comprimento em ácidos aminados
Região
1
2
3
4
5
6
7
8
Posição
2-32
33-382
33-69
70-79
80-217
218-241
242-382
383-657
Comprimento
Características
31 acid. aminad. Cabeça molecu.
350
“
Rod
37
“
Coil 1 A
10
“
Linker 1
138
“
Coil 1 B
24
“
Linker 2
141
“
Coil 2
275
“
Cauda
A lamina nuclear é dinâmica e pode despolimerizar-se como sucede
durante a mitose, para depois se polimerizar novamente quando
reentrar na interfase celular, o que parece ser devido a fosfatações e
desfosfatações nos resíduos que flaqueiam os domínios “coiled-coil”
das laminas (Ref. Wilson et, al. 2001 in NPD nuclear compartments).
O reassemble nuclear inicia-se quando as membranas nucleares se estruturam
sobre a cromatina.
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Figura 3
Formação de polimeros de Lâminas
“Cabeça”
“Cauda”
COOH
monómero
H2N
COOH
monómero
H2N
COOH
dímero
COOH
H2N
H2N
COOH
dímero
COOH
COOH
COOH
NH2
H2N
tetrâmero
NH2
H2N
COOH
(cadeias anti-paralelas)
COOH
Polimeros
Durante as primeiras fases da mitose o invólucro nuclear é
despolimerizado quando o factor de promoção da maturação (MPF)
entra no núcleo e inicia a fosfatação dos complexos poros nucleares
(NPC) e das proteínas da lâmina nuclear, seguida pela quebra dos
NPC e da lâmina.
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O reassemble nuclear inicia-se quando as membranas nucleares se
estruturam sobre a cromatina.
Nas funções atribuídas à lamina nuclear incluem-se a manutenção da
forma do núcleo, a organização dos poros nucleares, a regulação da
transcrição, a ancoragem da heterocromatina na interfase, e ainda a
replicação do DNA.
Está também assinalada a presença de laminas (lamins) no interior
do nucleoplasma parecendo que os poros por ela constituídos a este
nível estariam implicados na replicação do DNA.
Como já referimos, recentemente foram identificadas uma série de
doenças (laminopatias) devidas a nutações nos genes quer das
proteínas lâminas quer das proteínas que se associam a estas.
Durante anos lâminas do tipo A e moléculas com elas associadas
foram identificadas como envolvidas numa gama de desordens
genéticas (Broers, J.L.V. et, al., 2004).
Proteinas do folheto membranário interno (INM) do invólucro nuclear
(adaptado de NPD nuclear componente: nuclear lamina)
- Lamins
- LAP1 (lamina-associated protein 1) tem três isoformas α, β e ¥
- LAP2 – tem seis isoformas
- Emerina
- MAN1
- LBR (lamina β receptor)
- Otefin
- RFBP (ring finger binding protein)
- Nurim
Algumas características destas proteÍnas integrais da INM
- RFBP – têm 9 regiões transmembranárias (TMR)
- LBR – tem 8
‘’
‘’
‘’
- Nurim – tem 5 ‘’
‘’
‘’
- MAN1 – tem 2 ‘’
‘’
‘’
- A Emerina, todas as LAP1 isoformas e 4 das 6 LAP2 isoformas (β, §, α
e ¥) têm só uma região TMR
- As LAP2 α não têm TMR
- Todas as isoformas LAP1 e LAP2 α intereactuam preferencialmente
com “lamins” do tipo A, enquanto as LBR e LAP2 β interactuam com
“lamins” de tipo B e a Emerina interactua com ambos os tipos de
“lamins”.
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As laminopatias recaiem em três classes, a das doenças que afectam
os músculos estriados, as doenças que afectam os tecidos adiposos e
as que envolvem as neuropatias periféricas.
Estas doenças estão relacionadas com muito raros sÌndromas de
envelhecimento precoce (Ref. 52 in Broers, et,. 2004).
Referem-se nos dois quadros seguintes algumas proteínas que se
encontram no folheto membranário interno (INM) do invólucro
nuclear bem como algumas das suas características e nas duas
figuras seguintes esquemas das proteínas da membrana interna do
núcleo e das suas interacções com a lâmina nuclear e outros
componentes nucleoplásmicos.
Distribuição de algumas proteínas da membrana nuclear
interna e outras proteínas com que interactuam da lâmina
nuclear e do nucleoplasma.( Adaptado de Expert Reviews in
Molecular Medicine. 2002
Proteínas integrais da
Membrana nuclear interna
Poteinas da lamina nuclear
- Nurina
- RFBP
- Emerina (com domínios LEM)
- MAN 1 (com domínios LEM)
- LAP-2
- (β, γ, δ, ε) (com domínios LEM)
- LAP 1
- LBR
- Lamin B
- Lamin A
- Rush
- RNA polimerase
- Complexo 5remodelador da cromatina
Proteínas do nucleoplasma - Complexo de “splicing”
- BAF
-pRb
-GCL
- DP
- E2F
- HA95
- HP1
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Algumas interações entre algumas destas proteínas
- Nurim---------------Lamins
- RFBP—Rush-----RNA polimerase
Complexo remodelador da cromatina
Complexo de “splicing”
Lamins
Cromatina
- Emerina—BAF—Cromatina
---Lamins
- MAN1—BAF—Cromatina
--Lamins
- LAP-2—Lamins
(β,γ, δ,ε) --HA95
---BAF
--GCL—DP—E2F—pRb--Cromatina
Interacções( +) entre diversas proteínas e componentes da membrana
interna nuclear com a lâmina nuclear e outros componentes do
nucleoplasma ( adaptado de Expert Reviews in molecular medicine, 2002 e de
Froisner, R, 2001)
Membrana (INM)
Nurina
Nucleoplasma
→►Lamin A+ Lamin B
RFBBP
→►Rush+Cromatina+RNA polimerase+ Complexo
splicing+
Complexo remodelador da cromatina
Emerin
→►LEM domínio+BAF+BAF+BAF+LaminsA+B+Cromatina
MAN1
→►Lem+ BAF+Cromatina +Lamins A+B
LAP2 (β,γ,δ,ε)
→►LEM+ BAF+ GCL+ DP+ E2F+ Cromatina+Lamins
A+B
LAP-1
→► Lamins A+ B
LBR
→►BAF+ HA95+ Cromatina+ Lamins A+B
Cromatina+LAP-2α+ pRb+ BAF+Todos os outros
Componentes antes assinalados
Lamins A+B +pRb+ todos os outros componentes
assinalados
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Figura 4
Proteínas da membrana interna do núcleo e suas interacções com a lâmina
nuclear e outros componentes nucleoplasmicos (esquema sugerido)
Adaptado de Goldman, et al, 2002
Legenda
Lâmina nuclear e componentes nucleoplásmicos.
ONM – Membrana nuclear externa
INM – Idem Interna.
As interacções exactas e organização da INM, lâmina nuclear e cromatina são
desconhecidas sendo portanto este um esquema hipotético. 12 proteínas da INM
estão caracterizadas nos mamíferos (a nurina, lamin B receptor (LBR), ring – finger –
binding protein (RFBP); double- spanning membrane protein MAN1 e single-spanning
membrane proteins Emerin, LAP 2 e isoformas ( β,α,¥,--) e LAP-1 isoformas (A,B.C).
Ocorrem interacηυes entre as proteνnas da INM e as lamins tipo A (em azul) e lamins
tipo B (em laranja) que sγo proteνnas filamentosas helicoidais da lamina nuclear e do
nucleoplasma.
Lamins intranucleares ligam-se ΰ isoforma solϊvel LAP-2, LAP-2A.
Reguladores da transcriηγo intercruzam-se com proteνnas da INM e com a cromatina,
incluindo nelas a proteνna retinoblastoma (pBR); GCL; factor de transcriηγo EZF; e
RNApolimerase, complexo RNA splicing e DP protein.
As proteνnas que se ligam a heterocromatina incluem as HPI, BAF e HA95
--------------------------------------
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Figura 5
Membrana
NPC
Membrana
MAN 1
Lamina B
LBR
LAP2 : βγ
Emerina
Lamina β
Lamina A
HP1 : α β γ
BAF
DNA
LAP2 α
Topo II
Cromatina
Interacções esquemativas entre componentes do involucro nuclear, “lamini” e cromatina
1.5 –Outras proteínas interactuantes
cromatina e citoesqueleto celular
inclusive
com
a
Nas vias metabólicas operadas na maioria das reacções anabólicas e
catabólicas pelos seres vivos são bem conhecidas as diversas etapas
intervenientes, os metabolitos envolvidos, os respectivos gastos
energéticos, inter-relações estabelecidas e as consequências
funcionais respectivas.
No que se refere aos circuitos fisiológicos desenvolvidos no interior
dos núcleos ao longo de todo o complexo processo da sua vida
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biológica, ainda se ignora muito acerca da sua modelação e
regulação. Já se conhecem bastantes moléculas intervenientes, bem
como alguns detalhes da sua morfofisiologia, mas ainda se não
consegue reproduzir na totalidade todo o decurso operado entre uma
determinada causa efectora e o seu consequente efeito.
São alguns vislumbres deste complexo campo da biologia que
procuramos desenvolver seguidamente.
Quadro de interacções entre algumas proteínas
LAP1
LAP2α
LBR
→► Lamins
→ ►pRb
→►pRB
BAF
Cromatina
→►HP1
HA95- Cromatina
Lamins
Na regulação da cromatina e da transcrição pelas proteínas da INM
são conhecidas algumas interacções que são esquematizadas nos
quadros seguintes.
Regulação da cromatina e transcrição pelas proteínas da INM
(NPD – nuclear compartment)
-As lamins reprimem a transcrição através de interações da lamin A/C com a
proteína retinoblastoma (Rb) e da LBR, a qual pode ligar-se com a HP1
(hetero-Chromatin protein 1)
-A LBR e a LAP2β podem interactuar com a proteína cromossomal HÁ 95
-Várias outras proteínas, tais como todas as isoformas da LAP2, Emerina e
MAN1 possuem uma região ou domínio LEM (de 43 àcidos aminados) na sua
porção N-terminal que pode interactuar com uma proteína BAP (DNA-binding
protein)
-As lamins podem ainda interactuar com histonas âmago através das suas
caudas C-terminais
-Também a proteína da INM, RFBP, uma ATPase P-Tipo atípica pode
interactuar directamente com a família RUSH dos factores de transcrição
SWI/SNF-like.
Varias proteínas nucleoplásmicas interactuam com as lamins e/ou proteínas
integrais da INM, tais como:
-Proteínas da replicação do DNA
-RNA polimerase II transcrição
-Complexos de splicing
-Reguladores específicos da transcrição
-Modificadores da cromatina
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A cromatina pode interactuar com as seguintes proteínas, além de
outras
-Complexo remodelador da cromatina
-RNA polimerase
-Complexos de splicing
-Lamins tipo A - LAP1
Tipo B -LAP1
Rush
-BAF--------------Emerinas (dominis LEM)
MAN1 (domínios LEM)
-pRb
- DP---------LAP2 (β,γ,δ,ε) (domínios LEM)
-GCL
“
-LAP2α
-LBR
-HP1
-HA95
-RFBP
Vejamos seguidamente algumas características de cada uma destas
proteínas.
-Rush, é um membro do grupo de proteínas da família Smarca 3 das
máquinas remodeladoras de cromatina SWI-SNF, que interactua com
uma proteína da membrana nuclear interna e ligando-se também no
DNA do promotor proximal de pelo menos o gene uteroglobin.
-BAF (Barrier-to-autointegration factor) é uma proteina celular
altamente conservada que protége o DNA retroviral contra a
autointegração. As interacções do BAF com o DNA são não específicas
quanto a sequências do DNA. A interacção dupla do BAF com o DNA e
com a LAP 2, uma proteína associada com a lâmina nuclear, sugere
que ela tem um papel na organização do cromossoma.
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-LAP (Liver activator protein) é um membro da família C/EBP que induz
a expressão específica de certos genes ao nível do promotor.
-LAP 1 è um polipéptide associado com a lamina dentro do núcleo,
localizada na interfase, na membrana nuclear interna, com as formas A
e B interactuando com a lâmina A e funcionando na organização da
membrana nuclear e na sua biogénese.
As proteínas do invólucro nuclear estão envolvidas na regulação da
transcrição
-A LAP2β é uma proteína integral do invólucro nuclear contem um
domínio LEM que se liga à cromatina reprimindo a actividade
transcricional desencadeada pelo heterodímero E2F5 – DP3.
-EMERIN (EMD –( Emery – Dreifuss muscular dystrophy) é uma
proteína da membrana nuclear, rica em serina que medeia a
ancoragem da membrana nuclear ao citoesqueleto citosolico podendo
uma mutação do seu gene originar uma distrofia muscular.
-MAN1 (ou LEMD3) é uma proteína integral da membrana interna
nuclear cujas mutações originan osteopoikilosis Buschke – Alendorff
Syndrome e melorheostosis. O seu domio C-terminal nucleoplásmico
nos humanos liga-se a Smad 2 e Smad 3 e antagoniza os efeitos do
factor de crescimento â (TGF-â).
-pRb ou Rb (retinoblastona protein) é uma proteína supressora de
tumores habitualmente presente como uma fosfoproteína dentro das
células sendo uma alvo para fosfatação realizada por diversas cinases.
A pRb liga-se e inibe factores de transcrição da família E2F que são
dímeros de proteínas E2F e proteínas DP.
-DP protein. As duas proteínas DP conhecidas, a TFDP 1, e 2, ligam-se
à E2F para formar heterodímeros com alta afinidade para o DNA e com
eficiente activação/repressão da transcrição.
-GCL protein (Germ-cell-less) nas células de espécies mamiferas está
co-localizado com a LAP2β no invólucro nuclear e actua como um
componente da matriz nuclear e não como uma proteína integral da
membrana.
-LBR (Lamin β receptor) – é uma proteína multifuncional da membrana
nuclear interna envolvida no assembly nuclear e na ligação à
cromatina, ligando a heterocromatina e as lamins à membrana nuclear
,e passível de mutações que desencadeiam anomalias.
-HPI –é uma
proteína que se encontra associada com a
heterocromatina podendo interactuar com outras proteínas o que a
implica na regulação dos genes, replicação do DNA e arquitectura
nuclear.
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-RFBP (Ring-Finger binding protein) é uma proteina transmembranária
da periferia nuclear, localizada na interfase, na membrana nuclear
interna que interactua com os factores de transcrição RUSH.
A expressão da RPBP é ubíqua e correlacionada com as das proteínas
RUSH, sendo essa expressão regulada hormonalmente.
As três proteínas integrais da membrana nuclear interna LAP2â e á,
Emerina e MAN1 têm cerca de 70% de domínios LEM de 43 ácidos
aminados idênticos que parecem servir como um novo domínio para
ligação com a cromatina.
Nas proteínas que se ligam à heterocromatina incluem-se as HP1, as
BAF e as HÁ 95..
-HÁ 95 é uma proteína da cromatina e da matriz nuclear que regula a
dinâmica do invólucro nuclear (Martins, S.B.et, al., 2000), Na interfase
está firmemente associada com a cromatina e lâmina/matriz nuclear a
à cromatina na mitose, formando um complexo com o receptor da
lamins β (LBR) e com o LAP2 e Emerina, proteínas integrais da
membrana nuclear interna.
-E2F são uma família de factores de transcrição uns activadores e
outros supressores, todos eles envolvidos na regulação do ciclo celular
e na síntese do DNA nas células dos mamíferos. Os E2F ligam-se nas
sequências promotoras alvo TTTCGCGC (E2F – Wikipedia, the free
encyclopedia).
Modelo provável da interação núcleoesqueleto-citoesqueleto(
Starr e Fridolfson, 2010) e (Dahl, e tal.,2008)
Interações entre o núcleo e o citoesqueleto celular são mediadas por
pontes SUN-KASH no invólucro nuclear.As proteínas SUN (Sad1 e UNC84) e as proteínas KASH (Klarscht, ANC-1 e Syne/Nesperin homology).
Algumas combinações CASH_SUN ligam-se com microtúbulos,
centrossomas e filamentos de actina a filamentos intermediários à
superfície do núcleo.
Está descrito um modelo referido como LINC, ou seja, um ligador do
nucleoesqueleto com o citoesqueleto, constituído pelas proteínas
KASH-SUN, que admite que as proteínas SUN (Sad1 e UNC-84) na
membrana INM interactua com proteínas KASH na membrana ONM
para abarcar o invólucro nuclear. As forças geradas no citoplasma são
assim transferidas para a lamina nuclear. (Figura 6)
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Figura 6
Inter-relações de nucleoesqueleto com o citoesqueleto
Reticulo endoplasmico
Filamentos
intermediarios
Proteínas SUN
Proteínas KASH
Citoplasma
(citoesqueleto
)
NUCLEO
(núcleo esqueleto)
NPC
eucromatina
Filamento de
actina
Lâmina
ONM
INM
cromossoma
heterocromatina
Lâmina nuclear
Invólucro nucleico
LINC
Nas vias para transmossão de forças da matriz extracelulkar para o
núcleo, num modelo proposto,as forças externas podem actuar sobre a
célula através da deformação do substrato ou por compressão por
fluidos.
Através de integrinas, proteínas transmembranarias que ligam a matriz
extracelular com o citoesqueleto das células, ou sejam as integrinas
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ligam-se aos filamentos de actina já no citoesqueleto respondendo
desta forma a ligandos extracelulares e a sinais intracelulares.
No citoplasma celular os filamentos de actina, filamentos
intermediários e microtúbulos podem interactuar com plectin e
nesprin-3 nos ONM. Ao nível do invólucro nuclear, as nesprinas
(através dos domínios KASH) interactuam com proteinasa SUN que
atravessam o espaço perinuclear.
Na INM, as proteínas SUN podem ligar-se a lamins e outras proteínas
do invólucro nuclear, que por seu turno se podem ligar ao DNA e
cromatina, completando-se assim o circuito de transmissão entre o
núcleo e o citoesqueleto.
1.6 – Territórios cromossomais e sub organitos subnucleares
(Carmo-Fonseca, 2002)
O interior dos territórios cromossomais é percorrido por redes de
múltiplos canais altamente ramificados e interligados tornando essas
sequências genómicas profundamente inseridas nos cromossomas
acessíveis a diversíssimos reguladores , quer activadores quer
inibidores. Sucede ainda que dentro de cada cromossoma os
respectivos braços são mantidos afastados um do outro e as regiões
ricas em genes são separadas das regiões pobres em genes.
Nos mamíferos as fibras cromatínicas estão dobradas sobre si próprias
em domínios com diversos tamanhos (megabases) e ligados uns com
os outros, cada um desses domínios com megabases talvez
representando uma unidade funcional cuja replicação é coordenada e
mantida em ciclos celulares sucessivos (Meaburn e Misteli, 2007).
Os territórios cromossomais são dispostos de forma específica dentro
dos núcleos, com uns cromossomas tendendo a situar-se no interior do
núcleo e outros na periferia como já referimos; contudo a localização
de um cromossoma nas células individuais dentro de uma dada
população pode variar imenso sendo portanto mais um valor
probabilístico do que um valor absoluto.
Os arranjos cromossomais podem ainda depender do tipo de células e
tipo de tecido podendo variar esses arranjos ao longo da diferenciação
celular e desenvolvimento.
Na estrutura dos cromossomas os componentes que determinam
aspectos fundamentais do seu comportamento biológico são os
centrómeros, os telómeros e as origens da replicação (ORI) do DNA.
Os princípios básicos da estrutura e funcionamento dos centrómeros e
telómeros são relativamente bem conhecidos mas o mesmo não
sucede com as ORI. (Jackson, 2005).
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A distribuição destas ORI ao longo do cromossoma tem sido estudada.
Estas regiões interactuam com os complexos que as reconhecem
(ORC) sendo a síntese de DNA organizada de tal forma que regiões
específicas do genoma são replicadas em tempos precisos.
Da dinâmica da cromatina sabe-se que os domínios dos genes são
muito móveis e apresentam frequentemente movimentos de >500nm
as longo de períodos de 10 segundos, enquanto os telómeros e
centrómeros são relativamente imóveis (Jackson, 2005).
Os telomeros contactam com a membrana nuclear através de um
complexo que incorpora reguladores para silenciar a informação (Sir) e
Ku.
Os rápidos movimentos da cromatina observado nas leveduras está em
oposição com a cromatina das células eucariotas que se encontra
estavelmente associada com uma estrutura nuclear fixada, o que
talvez se justifique por as leveduras não terem filamentos proteicos
nucleares como a lamina nuclear que com as lamíns regula a
arquitectura genómica nas células eucariotas.
Recorda-se novamente que dentro do nucleoplasma os diversos
cromossomas encontram-se em territórios próprios, parecendo que os
genes residem à superfície destes territórios bem compactados
(Cremer et, al., citados em Spector 2001).
Na interfase, nos núcleos das células dos mamíferos os cromossomas
não aparecem emparelhados.
É também conhecido que em alguns tipos celulares a porção da
heterocromatina (inactiva portanto) dos cromossomas, se encontra por
dentro e associada com a lâmina nuclear, havendo também porções
dessa heterocromatina localizadas em zonas mais do interior do núcleo
associadas aquelas que se encontram na região pericentromérica, com
um grupo de proteínas Polycomb (por ex. RING1, BMII e p PG2)
constituindo os corpos PcG.
Os corpos PcG nos compartimentos nucleares são locais onde se
acumulam proteínas do grupo Polycomb (PcG) e por vezes situam-se
próximo dos locais onde se encontra heterocromatina constitutiva (NPD
Nuclear Compartments: PcG bodies) embora outras vezes tenham uma
distribuição nuclear uniforme.
Estes domínios PcG variam em número (desde 2 até centenas),
tamanho e composição proteica não se sabendo bem como intervêm
no silenciamento dos genes.
Proteínas PcG e complexos destas proteínas como por ex: o PRC – 1 e
PRC 2 estão envolvidos na modificação das histonas e em mecanismos
epigenéticos como por ex: o “imprinting” e a inactivação do
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cromossoma X nas fêmeas. Este complexo PRC 2 metila a lisina 27 da
histona H3 ( H3– K27).
Os PRC 2 e PRC1 são silenciadores da cromatina.
Os cromossomas formam portanto subestruturas distintas situadas em
posições definidas (O’Brien, T.P. et, al.,2003) durante a progressão do
ciclo celular e no núcleo em interfase.
Os genes não se encontram distribuídos ao acaso sobre os
cromossomas mas antes, como sucede com os genes transcritos em
alto grau (como é o caso dos genes “house Keeping”), formando
grandes aglomerados separados por outros domínios cromatínicos que
possuem genes pouco ou nada expressos.
Os complexos envolvidos na biogénese dos ribossomas existem
sobretudo nos nucleolos.
Os nucléolos onde ocorre a síntese de rRNA, e seu processamento e
montagem em subunidades ribossomais encontram-se em número de
1 a 5 nas células dos animais mamíferos existindo neles três regiões
bem distintas.
Nos três compartimentos que se podem considerar nos nucléolos existe
um compartimento fibrilhar central (com os genes r DNA) depois outro
compartimento onde ocorre a maturação dos transcritos pré-r RNA e
um terceiro compartimento onde ocorre a montagem das partículas
dos ribossomas (Carmo-Fonseca, 2000)
Nos nucléolos existem um conjunto de genes RNA ribossomais (rRNA)
repetidos em tandem tendo por principal função sintetizar e processar
rRNA (gerando os 5, 8S, 18S e 28S rRNA) e assemblar as subunidades
ribossomais que são depois exportadas para o citoplasma para tomar
parte na tradução do mRNA (Lamond & Sleeman, 2003).
Os nucléolos durante cada ciclo celular são dinâmicos e ora se autoorganizam ora se desorganizam até estabilizarem.
Genes ribossomais activamente transcritos são encontrados ao nível
dos nucléolos.(Figura 7)
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Figura 7
Moléculas de rRNA identicas
RNA
RNAr
DNA
inicio da
biossíntese da
molécula de
rRNA
Fim da biossíntese do RNA para a
construção de ribossomas
Transcrição dos genes ribossomais ao nível dos nucleolos
Existem varias centenas de genes idênticos para codificar rRNA a partir das moléculas de
DNA
Nas eucariotas os genes ribossomais são localizados em tandens
localizados em diversos cromossomas e estas regiões destes
cromossomas congregam-se num espaço tri-dimensional formando
dois ou três nucléolos em cada núcleo, cada nucléolo contendo material
genético de diversos cromossomas (Misteli, T. 2004).
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Há um compartimento perinucleolar (PNC) e ainda os SAM 68 “nuclear
body” (Huang, S. 2000, citado em Spector, DL, 2001), 1 a 10 por
núcleo que se encontram à superfície dos nucléolos e têm um papel no
metabolismo do RNA.
Outros compartimentos já referidos assinalados no espaço
nucleoplásmico entre a cromatina, são os “nuclear Speckles” (contendo
os componentes Spliceossomais), os corpos de Cajal (envolvidos na
biogénese dos sn RNP), os corpos nucleares PML (ricos em reguladores
da transcrição) e uma série de inclusões nucleares (Carmo- Fonseca,
M, 2002).
Os corpos PML são preferencialmente localizados em regiões do
genoma altamente activo transcriptionalmente.
10 a 30 corpos PML (Maul, G et, al. 2000, citados em Spector D.L.
2001) ND10 a POD ou Kr, encontram-se nos núcleos das células dos
animais mamíferos, contendo diversas proteínas que parecem intervir
na regulação da transcrição.
Além dos domínios anteriormente referidos e que se encontram na
generalidade dos núcleos das células dos mamíferos,existem outros
domínios que são específicos de um dado tipo de células ou de um
dado estádio fisiológico como por exemplo os corpos nucleares GATA1, HSF 1, etc.,
Os factores responsáveis pelo “splicing” dos pré-mRNA encontram-se
localizados em 25-50 manchas (domínios nucleares Speckles) ou
dispersos em todo o nucleoplasma (Spector, D. L, 1993 citado em
Spector 2001)
correspondendo algumas dessas manchas maiores a conjuntos de
grânulos intercromatínicos (IGC) parecendo estes intervir na
montageme/ou modificação dos factores de “splicing” do pré-mRNA.
Os “splicing speckles” são estruturas de forma irregular e de talhes
diversos da região intercromatínica, sendo estruturas dinâmicas que
contêm múltiplas cinases e fosfatases I parecendo participar na
reciclagem dos spliceossomas
Os locais de transcrição encontram-se disseminados no nucleoplasma,
inclusive na periferia das IGC, constituindo diversos milhares de focos.
Contudo diversos factores de transcrição, além de se mostrarem
difusamente distribuídos, também se podem concentrar em 1 a 3
compartimentos chamados domínios OPT (OCTI/PTF/transcription).
Estes compartimentos contêm transcritos em inicio e outros factores
implicados no respectivo processamento (Pombo et, al., 1998, citados
em Spector, 2001).
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Estes domínios OPT surgem na fase G1 e por vezes residem próximo
do nucléolo e desaparecem durante a fase S.
Os domínios OPT são pois locais onde se concentram factores de
transcrição necessários para as RNA polimerases.
Os corpos de Cajal tendem a co-localizar-se com as histonas e com os
genes U2 snRNA.
Em diversos tipos de células também aqueles factores de splicing prém RNA se localizam em 1 a 10 corpos de Cajal que se pensa intervirem
na biogénese de sn RNP e no seu tráfego (as subunidades
spliceossomais U1, U2, U4/U6 e U5 e U7 localizam-se nesta estrutura),
admitindo-se que possam mover-se através dos corpos de Cajal para
as manchas (nuclear speckles) ou nucléolos.
Os corpos de Cajal (Lamond & Sleeman, 2003) não contêm rRNA ou
genes rRNA mas sim outros factores e por vezes encontram-se
associados com loci de genes específicos, como genes das histonas e
genes sn RNA, contendo uma pequena parte de “small nuclear” RNP
(sn RNP) que são subunidades dos spliceossomas e também “small
nucleolar” RNP (sno RNP) que modificam e cindem os pré-rRNA.
Os corpos de Cajal, corpos espiralados, ou “coiled bodies” são pois
ribonucleoproteínas em forma de bastonete curvado, envolvidos nos
spliceossomas.
Os corpos “Gems” ou seja Gemins ou gémeos dos corpos de Cajal
encontram-se no nucleoplasma próximos dos corpos de Cajal e são do
mesmo tamanho que estes e estão envolvidos nos spliceossomas.
Diversos factores implicados especificamente na cisão e poliadenilação,
no processamento dos pré-m RNA encontram-se dispersos no núcleo e
também acantonados em 1 –4 focos nos corpos de quebra (Schal, W.
et. Al. 1996, citados em Spector, 2001) que se sobrepõem ou ficam
adjacentes aos corpos de Cajal.
1.7 – Movimentações Intranucleares
A maioria das estruturas compartimentadas contidas no núcleo
possuem uma certa capacidade de movimentação, embora restrita e
um tanto ao acaso, como é o caso dos corpos PML e dos corpos de
Cajal, que revelam no entanto uma certa direcção nesses movimentos
,que necessitam de energia, para ocorrer.
Alguns destes compartimentos nucleares à medida que modificam a
sua posição relativa dentro do núcleo podem deslocar-se para locais
onde interactuam com outras populações moleculares como sucede
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,por exemplo ,com outros domínios “manchas” (speckle domain)
quando se dirigem para um território de um cromossoma.
Há outras proteínas que se encontram em compartimentos específicos
do núcleo e que aqui residem apenas alguns segundos ou minutos,
migrando depois através do espaço intercromatínico, havendo no
entanto proteínas que se deslocam entre diferentes tipos de
compartimentos nucleares (O’Brien et, al., 2003).
A localização e as potencialidades de deslocação dos cromossomas, de
uns em relação aos outros, durante a interfase refletem-se, na
composição dos cromossomas, e nas associações com o invólucro
nuclear mediadas por proteínas.
Em cada cromossoma existem uma série de conformações estruturais
condensadas e não condensadas.
Os complexos remodeladores da cromatina condicionam territórios dos
cromossomas, e os espaços entre estes.
A expressão dos genes ao nível dos cromossomas pode estar associada
com a sua vizinhança de um poro do núcleo, ou com a sua localização
na zona periférica do núcleo, ou com corpos nucleares específicos
como
por
ex:
os
PML,
ou
ainda
com
o
estado
de
condensação/descondensação da zona cromossomal em questão, e
portanto a descondensação levando essa região fibrosa muito grossa
de cromatina a tornar-se uma zona fibrosa muito mais fina susceptível
de transcrição, inclusive com a formação de ansas de DNA que
permitem a activação dos sistemas enzimáticos transcriptionais.
Dinâmica dos compartimentos e componentes nucleares (Figura 8)
Os movimentos indicados pelas setas podem ser ao acaso, ou com
troca de proteínas, ou mudanças de forma do compartimento, ou de
troca de proteínas entre os compartimentos.(adaptado de O’Brien, et,
al. 2003)
1.8 – Gradientes de pH intranucleares
Admitimos que pequenas flutuações de pH a nível subcelular possam
estar envolvidos na dinâmica observada no interior do núcleo.
É sabido que o pH intracelular desempenha um papel fundamental no
funcionamento celular, no crescimento e desenvolvimento dos animais.
Organitos isolados, tais como mitocôndrias ou lisossomas têm
gradientes de pH relativamente ao citosol envolvente.
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Figura 8
Dinamica dos compartimentos e componentes nucleares
(As setas indicam essa dinamica intra ou inter compartimentos)
Corpos de cajal
speckles
cromatina
nucleolo
nucleolo
cromatina
PML
cromossoma
Corpos de cajal
Os movimentos indicados pelas setas podem ser ao acaso, ou com troca de proteínas, ou mudanças de
forma do compartimento cujas trocas de proteínas ocorre entre os compartimentos
Em relação ao pH nuclear, sabe-se que o seu valor é consistentemente
0,3 a 0,5 unidades mais alto que o do citosol (Seksek e Bolard, 1996),
vide quadro seguinte:
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Tipo de células
Local
Macrofagos
Citoplasma
Núcleo
Citoplasma
Núcleo
Citoplasma
Nuclep
Citoplasma
Núcleo
CHO
J774g8
3T3
pH (P<0,05)
7.24+-0.05
7.55+-0.05
7.37+-0.18
7.63+-0.17
7.20+-0.27
7.68+-0.16
7.49+-0.16
7.77+-0.08
Nº de células
80
30
31
34
Apesar da presença de poros na membrana nuclear, que parecia
apontar para a livre difusão de iões e pequenas moléculas para dentro
e para fora do núcleo, este trabalho avança que estas células através
da membrana nuclear apresentam uma barreira à permeabilidade
protonica do H+, indicando portanto restrições ao fluxo de iões
monoatómicos.
Há portanto um gradiente evidente de pH entre o núcleo e o
citoplasma celular.
Recorda-se que durante a mitose das células a membrana nuclear
desagrega-se
voltando
a
reorganizar-se
posteriormente
e
curiosamente durante a mitose quando a membrana nuclear
desaparece os cromossomas condensam-se e certamente nesta fase
do ciclo celular o gradiente de pH entre o núcleo e o citoplasma alterase.
Será o pH celular ao nível cromatínico nesta altura do ciclo celular,
mais acídico e terá alguma coisa a ver com a condensação
cromossómica?
Posteriormente, com o decorrer do ciclo celular a membrana nuclear
volta a surgir com a descondensação dos cromossomas, ao mesmo
tempo que certamente se restabelece o gradiente de pH entre o núcleo
e o citosol, com este mais acidico e aquele menos acídico,
inclusivamente com uma diferente dinâmica dos gradientes protónicos.
Terá este gradiente de pH algo a ver com os domínios cromatínicos, o
super enrolamento cromatínico, e os sistemas enzimáticos envolvidos
na despolimerização/polimerização da remodelação da cromatina e
modificação das histonas?
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Este artículo divulgativo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080811.html
concretamente en
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