...

Biomarcadors d'exposició dietètica nutricionals d'intervenció i observacionals. Aplicació

by user

on
Category: Documents
11

views

Report

Comments

Transcript

Biomarcadors d'exposició dietètica nutricionals d'intervenció i observacionals. Aplicació
Biomarcadors d'exposició dietètica en estudis
nutricionals d'intervenció i observacionals. Aplicació
d’una aproximació metabolòmica HPLC-q-ToF-MS per a
la millora de la capacitat predictiva a través de models
combinats multi-metabòlit
Mar Garcia Aloy
ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió
d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat
autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats
d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició
des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra
o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de
la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora.
ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La
difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB
(diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos
privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro
ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza
la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta
reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de
partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora.
WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the
TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the
intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative
aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital
Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not
authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or
citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author.
UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE FARMÀCIA
DEPARTAMENT DE NUTRICIÓ I BROMATOLOGIA
BIOMARCADORS D'EXPOSICIÓ DIETÈTICA
EN ESTUDIS NUTRICIONALS D'INTERVENCIÓ I
OBSERVACIONALS. APLICACIÓ D’UNA
APROXIMACIÓ METABOLÒMICA HPLC-q-ToF-MS
PER A LA MILLORA DE LA
CAPACITAT PREDICTIVA A TRAVÉS DE
MODELS COMBINATS MULTI-METABÒLIT
MAR GARCIA ALOY
2014
UNIVERSITAT DE BARCELONA
FACULTAT DE FARMÀCIA
DEPARTAMENT DE NUTRICIÓ I BROMATOLOGIA
Programa de Doctorat
ALIMENTACIÓ I NUTRICIÓ
2010-2014
BIOMARCADORS D'EXPOSICIÓ DIETÈTICA
EN ESTUDIS NUTRICIONALS D'INTERVENCIÓ I
OBSERVACIONALS. APLICACIÓ D’UNA
APROXIMACIÓ METABOLÒMICA HPLC-q-ToF-MS
PER A LA MILLORA DE LA
CAPACITAT PREDICTIVA A TRAVÉS DE
MODELS COMBINATS MULTI-METABÒLIT
Memòria presentada per Mar Garcia Aloy per a optar al títol de doctor per
la Universitat de Barcelona, dirigit per:
Dra. Cristina Andrés Lacueva
Dr. Rafael Llorach Asunción
(Directora/Tutora)
(Director)
MAR GARCIA ALOY
2014
"L'aprenentatge és experiència, la resta és informació"
Albert Einstein
Aquest treball ha estat finançat per:
Ministeri d’Economia i Competitivitat
Projecte AGL 2009-13906-C02-01
Programa Ingenio-Consolider FUN-C-FOOD (CDS
2007-063)
Acció Complementària AGL2010-10084-E
Fons Europeu de Desenvolupament Regional (FEDER)
Fundació Salut 2000 – Ajudes d’Investigació Merck
Serono 2010 (FBG305988; 2010-2013)
Burson Masteller S.L. – Convocatòria d’ajudes “Pan
cada día” 2011 (FBG306527; 2011-2012)
Agència de Gestió d'Ajuts Universitaris i de Recerca
(AGAUR) – Generalitat de Catalunya
Ajuts destinats a universitats, centres de recerca i fundacions hospitalàries per a la contractació del personal investigador novell (FI-DGR 2011)
Agraïments
Haver arribat fins a aquest moment no ha estat fruit de la casualitat ni únicament de l'esforç que hi hagi pogut destinar per mi mateixa. Ha estat en gran part per la confiança que
moltes i moltes persones han bolcat en mi i en tot el coneixement que m'han permès adquirir, no únicament cientificotècnic sinó també personal i emocional. Sou moltíssimes
les persones a les que us he agrair i dedicar aquest minúscul exemplar dedicat a l’aplicació
que ofereix la petita de la família de les òmiques a la gran disciplina de la nutrició i l’alimentació.
En primer lloc, vull donar les gràcies a la Dra. Andres-Lacueva i al Dr. Llorach per ferme un espai dins la seva trajectòria professional. Gràcies Cristina per la confiança que
has dipositat en mi i donar-me l'oportunitat per seguir aquest camí en una fase tant important. Agrair-te Rafa per haver-me guiat en cadascun dels esglaons de l'apassionant
"untargeted metabolomics workflow". És tot un honor haver pogut iniciar la tanda de tesis
metabolòmiques formant part del vostre equip!
L'etapa predoctoral no hagués estat la mateixa sense totes i tots els companys de laboratori, amb qui hem compartit espai, milers de cafès i algun sopar per mirar de trencar amb
la rutina diària. A la Rosa, la gran companya del viatge AGL sempre amb un somriure
d'orella a orella preparat, a la Montse per estar sempre disposada a ajudar en tot allò que
li sigui possible, a la Boto per prioritzar l'optimisme davant de tot, a la Sara per les converses i consells proporcionats durant tota aquesta fase, a la Rotchés per procurar-se que
em sentís com un membre més del grup des del primer dia, i a la resta de companys per
fer del laboratori un espai idoni per treballar dia rere dia: gràcies Mireia, Olha, Xymena,
Enrique, Marisa i Fran.
A la Dra. Olga Jáuregui per totes les magnífiques classes de cromatografia i espectrometria de masses. Però no només això, moltes més gràcies per als consells, la paciència, i el
temps i hores dedicades durant la intensa estada al Parc.
x
A tots aquells que durant aquesta petita trajectòria heu estat al meu costat, heu respectat
les decisions preses i heu procurat que en tot moment trobi l'equilibri entre l'apassionant
món de la recerca i el gaudir d’una magnífica vida real plena de bons moments. Per respectar-me en els períodes "d'Erasmus" i per trucar quan feia pocs dies que no ens comunicàvem. Gràcies Anna, Ivo, Roldi, David, Ester, Miquel, Mireia, Sergi, Save, Guille,
Pety, Marcmo, Iris, Kete i Aida, Eva i Mario,..... i a tota la resta de la troupe iGuai!
I als que sempre han estat i estaran al meu costat: gràcies mare i pare, Aleix, Ester, Josep,
i a la resta de la família per respectar-me i al mateix temps preocupar-vos perquè en cap
moment em falti ni una gota d’atenció, suport o estima. I molt especialment als meus avis:
Rossita, Cristòbal, Lola, Pere, Eusebio i Alfonsa. Tots vosaltres també m’heu ajudat en
aquesta història: gràcies a totes i cadascuna de les vegades que m'heu preguntat a què em
dedico heu fet que aprengui sobre la divulgació científica, tot intentant fer comprendre
això tan tècnic que en aquí presento de la manera més clara possible i mirant d’exposar
les raons pràctiques de tant d’esforç.
Llista de Publicacions
Revisió bibliogràfica 1
Llorach R*, Garcia-Aloy M*, Tulipani S, Vazquez-Fresno R, Andres-Lacueva C. Nutrimetabolomic strategies to develop new biomarkers of intake and health effects. Journal
of Agricultural and Food Chemistry. 2012;60(36):8797-8808. doi: 10.1021/jf301142b.
*Igual contribució
Revisió bibliogràfica 2
Trespalacios MP, Tulipani S, Garcia-Aloy M, Zamora-Ros R, Rotchés-Ribalta M, Rabassa M, Urpi-Sarda M, Boto M, Vázquez R, Llorach R, Andrés-Lacueva C. Nutritional
Biomarkers: Applications and Challenges. A: Morrisson JL (editor). Food Intake: Regulation, Assessing and Controlling. Nova Science Publishers, Inc.; 2013. ISBN: 978-161324-183-7.
Revisió bibliogràfica 3
Khan N, Khymenets O, Urpí-Sardà M, Tulipani S, Garcia-Aloy M, Monagas M, MoraCubillos X, Llorach R, Andres-Lacueva C. Cocoa polyphenols and inflammatory markers
of cardiovascular disease. Nutrients. 2014;6(2):844-880. doi: 10.3390/nu6020844.
Publicació original 1
Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Salas-Salvadó J, Martínez-González MA, Corella D, Fitó M, Estruch R, Serra-Majem L, Andres-Lacueva C. Nutrimetabolomics fingerprinting to identify biomarkers of bread exposure in a free-living population
from the PREDIMED study cohort. Metabolomics. 2014 [en premsa]. doi: 10.1007/
s11306-014-0682-6.
xii
Publicació original 2
Tulipani S, Llorach R, Jáuregui O, López-Uriarte P, Garcia-Aloy M, Bullo M, SalasSalvadó J, Andrés-Lacueva C. Metabolomics unveils urinary changes in subjects with
metabolic syndrome following 12-week nut consumption. Journal of Proteome Research.
2011;10(11):5047-5058. doi: 10.1021/pr200514h.
Publicació original 3
Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-SardaM, Tulipani S, Estruch R, Martínez-González MA,
Corella D, Fitó M, Ros E, Salas-Salvadó J, Andres-Lacueva C. Novel multi-metabolite
prediction of walnut consumption by a urinary biomarker model in a free-living population: the PREDIMED study. Journal of Proteome Research. 2014;13(7):3476-3483. doi:
10.1021/pr500425r.
Publicació original 4
Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Garcia-Aloy M, Monagas M, Andres-Lacueva C.
Metabolomic fingerprint in patients at high risk of cardiovascular disease by cocoa intervention. Molecular Nutrition & Food Research. 2013; 57(6):962-973. doi: 10.1002/mnfr.
201200736.
Publicació original 5
Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-Sarda M, Jáuregui O, Salas-Salvadó J, Martínez-González MA, Corella D, Fitó M, Estruch R, Andrés-Lacueva C. Untargeted metabolomics
approach to obtain a metabolic footprint of regular dietary consumption by designing
models of combined urinary biomarkers: Cocoa product intake in free-living subjects
from the PREDIMED study. [En procés de publicació].
Abreviacions
AHA
Associació Americana del Cor (de l’anglès, American Heart Association)
ANOVA
Anàlisi de la variància (de l’anglès, Analysis of Variance)
AUC
Àrea sota la corba (de l’anglès, Area Under the Curve)
EFSA
Autoritat Europea de Seguretat Alimentària (de l’anglès, European Food Safety Authority)
ESI
Ionització per electrosprai (de l’anglès, Electrospray Ionization)
HDL
Lipoproteïnes d’alta densitat (de l’anglès, High-Density Lipoproteins)
HCA
Anàlisi de clústers jeràrquics (de l’anglès, Hierarchical Cluster
Analysis)
HMDB
Base de dades del metaboloma humà (de l’anglès, Human Metabolome Database)
HPLC-q-ToF-MS
Cromatografia líquida d’alta resolució acoblada a espectrometria
de masses amb analitzador híbrid quadrupol-temps de vol (de
l’anglès, High-Performance Liquid Chromatography coupled to
quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry)
IMC
Índex de Massa Corporal
ISRCTN
Número Estàndard Internacional d’Assaig Clínic Controlat i Aleatoritzat (de l’anglès, International Standard Randomized Controlled Trial Number)
KEGG
Enciclopedia “Kyoto” de Gens i Genomes (de l’anglès, Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes)
xiv
LC-MS
Cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (de
l’anglès, Liquid-Chromatography coupled to Mass Spectrometry)
LDL
Lipoproteïnes de baixa densitat (de l’anglès, Low-Density Lipoproteins)
MS/MS
Espectrometria de masses en tàndem
m/z
Relació massa/càrrega
NuGO
Organització Europea de Nutrigenòmica (de l’anglès, European
Nutrigenomics Organisation)
OMS
Organització Mundial de la Salut
OPLS-DA
Anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials ortogonal (de
l’anglès, Orthogonal Partial Least Square Discriminant Analysis)
OSC
Correcció ortogonal de les senyals (de l’anglès, Orthogonal Signal Correction)
PCA
Anàlisi de components principals (de l’anglès, Principal Component Analysis)
PLS-DA
Anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials (de l’anglès,
Partial Least Square Discriminant Analysis)
PREDIMED
Prevenció amb Dieta Mediterrània
QC
Control de qualitat (de l’anglès, Quality Control)
ROC
Corba de rendiment diagnòstic (de l’anglès, Receiver Operating
Characteristic Curve)
RT
Temps de retenció (de l’anglès, Retention Time)
SUS
Estructures compartides i úniques (de l’anglès, Shared and Unique Structures)
VIH
Virus de la Immunodeficiència Humana
VIP
Importància de la variable en la projecció (de l’anglès, Variable
Importance for Projection)
Índex
Interès, Hipòtesis i Objectius .............................................................................
1
Interès ..................................................................................................................
3
Hipòtesis ..............................................................................................................
9
Objectius ..............................................................................................................
11
ANTECEDENTS BIBLIOGRÀFICS
Introducció .........................................................................................................
15
Capítol 01. Aplicació de la Nutrimetabolòmica en el Descobriment de Biomarcadors d’Ingesta i d’Efecte en la Salut .......................................................
17
Revisió bibliogràfica 1: Llorach R, Garcia-Aloy M, Tulipani S, VazquezFresno R, Andres-Lacueva C. Nutrimetabolomic strategies to develop new
biomarkers of intake and health effects. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 2012;60(36):8797-8808. doi: 10.1021/jf301142b.
Capítol 02. Biomarcadors Nutricionals ............................................................
Revisió bibliogràfica 2: Trespalacios MP, Tulipani S, Garcia-Aloy M, Zamora-Ros R, Rotchés-Ribalta M, Rabassa M, Urpi-Sarda M, Boto M, Vázquez R, Llorach R, Andrés-Lacueva C. Nutritional Biomarkers: Applications
and Challenges. A: Morrisson JL (editor). Food Intake: Regulation, Assessing and Controlling. Nova Science Publishers, Inc.; 2013. ISBN: 978-161324-183-7.
31
xvi
Capítol 03. Consum de Cacau i Malaltia Cardiovascular: Exemple dels
Efectes dels Components de la Dieta en la Salut ..............................................
65
Revisió bibliogràfica 3: Khan N, Khymenets O, Urpí-Sardà M, Tulipani S,
Garcia-Aloy M, Monagas M, Mora-Cubillos X, Llorach R, Andres-Lacueva
C. Cocoa polyphenols and inflammatory markers of cardiovascular disease.
Nutrients. 2014;6(2):844-880. doi: 10.3390/nu6020844.
METODOLOGIA
Capítol 04. Disseny dels Estudis Nutricionals .................................................
107
4.1. Estudis d’intervenció ....................................................................................
107
4.2. Estudi observacional . ..................................................................................
114
Capítol 05. Anàlisi Metabolòmic No Dirigit per HPLC-q-ToF-MS .............
121
5.1. Preparació de la mostra d’orina ....................................................................
122
5.2. Adquisició de dades: anàlisi HPLC-q-ToF-MS ...........................................
122
5.3. Anàlisi de dades ...........................................................................................
126
5.4. Identificació dels marcadors .........................................................................
138
5.5. Interpretació biològica ..................................................................................
144
RESULTATS
Capítol 06. Identificació de Biomarcadors d’Ingesta de Pa en una Població
en Condicions de Vida Lliure ............................................................................
Publicació original 1: Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani
S, Salas-Salvadó J, Martínez-González MA, Corella D, Fitó M, Estruch R,
Serra-Majem L, Andres-Lacueva C. Nutrimetabolomics fingerprinting to
identify biomarkers of bread exposure in a free-living population from the
PREDIMED study cohort. Metabolomics. 2014 [en premsa]. doi: 10.1007/
s11306-014-0682-6.
147
Índex
xvii
Capítol 07. Estudi Metabolòmic de l’Efecte de la Fruita Seca en Individus
amb Síndrome Metabòlica ................................................................................
173
Publicació original 2: Tulipani S, Llorach R, Jáuregui O, López-Uriarte P,
Garcia-Aloy M, Bullo M, Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. Metabolomics unveils urinary changes in subjects with metabolic syndrome following
12-week nut consumption. Journal of Proteome Research, 2011;10(11):
5047-5058. doi: 10.1021/pr200514h.
Capítol 08. Biomarcadors Nutricionals del Consum de Nous: Noves Estratègies per al Disseny de Patrons de Biomarcadors ...........................................
193
Publicació original 3: Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani
S, Estruch R, Martínez-González MA, Corella D, Fitó M, Ros E, Salas-Salvadó J, Andres-Lacueva C. Novel multi-metabolite prediction of walnut consumption by a urinary biomarker model in a free-living population: the PREDIMED study. Journal of Proteome Research. 2014; 13(7):3476-3483. doi:
10.1021/pr500425r.
Capítol 09. Estudi Metabolòmic de l’Efecte del Cacau en Pols en Individus
amb Elevat Risc Cardiovascular .......................................................................
215
Publicació original 4: Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Garcia-Aloy
M, Monagas M, Andres-Lacueva C. Metabolomic fingerprint in patients at
high risk of cardiovascular disease by cocoa intervention. Molecular Nutrition & Food Research. 2013;57(6):962-973. doi: 10.1002/mnfr.201200736.
Capítol 10. Anàlisi de l’Empremta Metabòlica del Consum Habitual de
Productes Derivats del Cacau en Individus en Condicions de Vida Lliure ..
Publicació original 5: Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-Sarda M, Jáuregui
O, Corella D, Martínez-González MA, Salas-Salvadó J, Fitó M, Ros E, Estruch R, Andres-Lacueva C. Untargeted metabolomics approach to obtain a
metabolic footprint of regular dietary consumption by designing models of
combined urinary biomarkers: Cocoa product intake in free-living subjects
from the PREDIMED study. [En procés de publicació]
235
xviii
DISCUSSIÓ I CONCLUSIONS
Capítol 11. Discussió General ............................................................................
263
11.1. Biomarcadors d’exposició dietètica en estudis nutricionals amb dissenys
diferenciats ..........................................................................................................
263
11.2. Disseny de models de biomarcadors per a la millora de la predicció de
l’exposició dietètica .............................................................................................
265
11.3. Caracterització de les empremtes metabòliques per a la determinació de
biomarcadors d’ingesta: importància del “food metabolome” .............................
267
11.4. Descobriment de marcadors d’efecte associats a la ingesta de determinats
aliments ................................................................................................................
268
11.5. Perspectives de futur ...................................................................................
269
Conclusions ........................................................................................................
271
REFERÈNCIES
Referències Bibliogràfiques ..............................................................................
275
ANNEX
Altres Publicacions en Revistes .........................................................................
293
Publicació I: Fernández-Albert F, Llorach R, Garcia-Aloy M, Ziyatdinov A,
Andrés-Lacueva C, Perera A. Intensity drift removal in LC/MS metabolomics by Common Variance Compensation. Bioinformatics. 2014 [en
premsa]. doi: 10.1093/bioinformatics/btu423 .................................................
293
Publicació II: Vázquez-Fresno R, Llorach R, Marinic J, Tulipani S, GarciaAloy M, Jiménez E, Espinosa-Martos I, Rodriguez JM, Andrés-Lacueva C.
Urinary metabolic biomarkers in women with mastitis after consumption of
a probiotic. A 1H-NMR-based metabolomic approach. Pharmacological Research. 2014 [en premsa]. doi: 10.1016/j.phrs.2014.05.010 ............................
303
Índex
Altres Capítols de Llibres ..................................................................................
xix
315
Capítol de llibre I: Vázquez-Fresno R, Tulipani S, Khymenets O, UrpíSardà M, Garcia-Aloy M, Rabassa M, Boto-Ordóñez M, Rotchés-Ribalta M,
Llorach R, Andrés-Lacueva C. Emerging Applications of Metabolomics to
Polyphenols and CVD Biomarker Discovery. A: Watson RR, Preedy VR,
Zibadi S (editors). Polyphenols in Human Health and Disease. Elsevier;
2014. ISBN: 978-0-12398-456-2 ....................................................................
315
Capítol de llibre II: Rabassa M, Zamora-Ros R, Tulipani S, Khymenets O,
Urpi-Sarda M, Garcia-Aloy M, Boto M, Vázquez R, Rotches-Ribalta M,
Chiva G, Trespalacios MP, Llorach R, Andres-Lacueva C. Flavonoids from
food and its implication in human health. A: Yamane K, Kato Y (editors):
Handbook of flavonoids: dietary sources, properties and health benefits.
Nova Science Publishers; 2012. ISBN: 978-1-61942-052-6 ...........................
317
Capítol de llibre III: Boto-Ordoñez M, Urpi-Sarda M, Monagas M, Tulipani S, Llorach R, Rabassa-Bonet M, Garcia-Aloy M, Queipo-Ortuño MI,
Estruch R, Tinahones F, Bartolomé B, Andres-Lacueva C. Phenolic acids
from microbial metabolism of dietary flavan-3-ols. A: Munné-Bosch S (editor): Phenolic acids: composition, applications and health benefits. Nova
Science Publishers; 2012. ISBN: 978-1-61942-040-3 .....................................
319
Capítol de llibre IV: Rotches-Ribalta M, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Trespalacios P, Rabassa-Bonet M, Boto-Ordóñez M, Vazquez-Fresno R, GarciaAloy M, Llorach R, Andres-Lacueva C. Metabolism and pharmacokinetics
of resveratrol: sources and food matrix on the bioavailability of resveratrol.
A: Delmas D (editor): Resveratrol: sources, production, and health benefits.
Nova Science Publishers; 2012. ISBN: 978-1-62081-997-5 ...........................
321
Capítol de llibre V: Rabassa M, Trespalacios MP, Urpi-Sardà M, Llorach
R, Tulipani S, Zamora-Ros R, Garcia-Aloy M, Andrés-Lacueva C. Polifenoles como antioxidantes. A: González-Aguilar GA, Ayala Zavala JF, ÁlvarezParrilla E, de la Rosa L (editors): Antioxidantes en alimentos y salud. Clave
Editorial; 2012. ISBN: 978-607-437-207-6 ....................................................
323
Comunicacions a Congressos ............................................................................
325
Interès, Hipòtesis i Objectius
Interès
Les malalties cròniques no transmissibles (com la malaltia cardiovascular o el càncer) són
la principal causa de mortalitat a nivell mundial (OMS 2011). Un elevat percentatge dels
casos d’aquestes malalties es pot prevenir mitjançant un estil de vida saludable, sent l’alimentació un dels factors més importants i influents. No obstant, els mecanismes exactes
pels quals la dieta i els seus components afecten a l’organisme humà no són completament
coneguts. Aquest fet ha comportat un creixent interès en el coneixement de la biodisponibilitat dels components bioactius de la dieta amb la finalitat d’investigar el seu potencial
paper en la reducció del risc de desenvolupar malalties i en la millora de la qualitat de
vida, de poder efectuar recomanacions dietètiques, o de poder ser considerats com a nous
ingredients de futurs aliments funcionals (Kris-Etherton et al. 2002).
L’avaluació dels efectes de l’alimentació sobre la salut requereix disposar de resultats
obtinguts en estudis que permetin obtenir conclusions amb el màxim grau d’evidència
científica i, a partir d’aquesta informació, poder elaborar recomanacions sòlides i fiables
per als consumidors. Per aquest motiu, la mesura precisa de la ingesta dietètica és un
factor crucial en els estudis que analitzen la relació entre l’alimentació i la salut. Tradicionalment, les dades d’ingesta s’han obtingut a partir d’enquestes alimentàries. Els mètodes més habitualment utilitzats són els qüestionaris de freqüència de consum d’aliments,
els recordatoris de 24 hores o els registres dietètics. No obstant, tot i ser els mètodes més
utilitzats, presenten una sèrie de limitacions metodològiques degudes a errors sistemàtics
i aleatoris que cal tenir presents, com per exemple, la infravaloració de la ingesta energètica; la distorsió de la ingesta alimentària, de manera que la dieta resulti ser més saludable
(és a dir, la declaració d’un menor consum d’aliments poc saludables i una major ingesta
d’aliments saludables); la limitació en el llistat dels aliments considerats; possibles errors
que es poden acumular en el moment de convertir els registres d’aliments en compostos
individuals mitjançant la informació procedent de les taules de composició d’aliments; o
la no estimació de la variabilitat diària i estacional del consum dels diferents aliments
(Bingham 2002; Livingstone i Black 2003).
4
Interès, Hipòtesis i Objectius
Aquests inconvenients poden atenuar les estimacions de risc relatiu i disminuir el poder
estadístic dels estudis (Bingham et al. 2003; Kaaks i Ferrari 2006) i s’han apuntat com
una de les causes d’algunes de les inconsistències reportades entre alimentació i salut en
la bibliografia científica, ja que els efectes de la dieta sobre els factors de risc podrien
estar distorsionats degut als errors en l’avaluació de la ingesta (en el cas dels estudis observacionals) o bé degut a una falta de compliment de la intervenció nutricional assignada
(en el cas dels estudis d’intervenció) (Kristal et al. 2005).
Enfront d’aquesta situació, i davant la necessitat d’obtenir una valoració de la ingesta més
acurada, els biomarcadors nutricionals han sorgit com una eina precisa i objectiva per a
la determinació de l’exposició o ingesta dietètica que podria complementar les dades obtingudes a partir de les enquestes d’alimentació (Jenab et al. 2009). Els biomarcadors
s’han definit com “una característica que és objectivament mesurada i avaluada com un
indicador dels processos fisiològics, processos patològics o respostes farmacològiques a
una intervenció terapèutica” (Biomarkers Definitions Working Group 2001). Els biomarcadors es poden dividir en 3 categories: i) els biomarcadors d’exposició, definits com
aquells compostos exògens, o algun dels seus metabòlits, que poden ser mesurats en alguna mostra biològica de l’organisme; ii) els biomarcadors d’efecte, definits com aquells
elements mesurables relacionats amb una alteració bioquímica o fisiològica en l’organisme que, depenent de la magnitud, es pot associar amb un possible deteriorament en la
salut o malaltia; i iii) els biomarcadors de susceptibilitat, definits com aquelles substàncies indicadores de la capacitat de l’organisme per respondre a una determinada exposició
(OMS 1993; Schulte 2005).
Dins del camp de les ciències de l’alimentació, un biomarcador nutricional és qualsevol
indicador bioquímic, funcional o clínic mesurat en una mostra biològica que reflexa l’estat nutricional respecte a la ingesta o al metabolisme dels components de la dieta, així
com de les conseqüències biològiques de la ingesta alimentària (Potischman i
Freudenheim 2003). Un biomarcador d’exposició dietètica ideal hauria d’indicar amb
precisió el nivell d’ingesta alimentària i hauria de ser específic, sensible i aplicable a un
gran nombre de poblacions (Jenab et al. 2009). En aquest aspecte, s’han establert els criteris més importants que cal tenir en compte a l’hora d’utilitzar un biomarcador d’exposició dietètica (Taula 1).
A la vegada, davant el creixent interès en la formulació per part de la indústria alimentària
dels productes coneguts com a “aliments funcionals” ha sorgit la necessitat de disposar
Interès
5
Aspectes
analítics
Aspectes biològics
Taula 1. Consideracions biològiques i analítiques per al desenvolupament de marcadors
d’exposició dietètica.
Relació coneguda
amb l’exposició
L’associació entre la ingesta dels aliments i el marcador d’exposició ha de ser causal, és a dir, el marcador ha de ser un compost
o metabòlit conegut present en l’aliment.
Sensibilitat i
Especificitat
El marcador ha de ser tan particular de l’element avaluat com
sigui possible, per a què el percentatge de valors reals positius a
l’exposició (sensibilitat) i de valors reals negatius a la no exposició (especificitat) resulti ser tan elevat como sigui possible.
Dosi-resposta
Hi ha d’haver una associació positiva coneguda entre el nivell
d’exposició i el nivell mesurat del marcador.
Variació
interindividual
Cal investigar les principals fonts de variació interindividual,
com per exemple genotips, gènere, edat, tabaquisme, microbiota
intestinal, etc.
Temps d’exposició
Cal determinar si es tracta d’un marcador d’exposició de curt
termini (reflecteix el consum recent d’un aliment) o de llarg termini (reflecteix la ingesta habitual).
Població
Cal tenir en compte la població en la què el marcador d’exposició es pot aplicar.
Mostra
Cal definir el tipus de mostra, el moment de la seva recollida, i
les condicions d’emmagatzematge i preparació.
Mesura definida
El marcador ha de ser quantificable mitjançant un mètode definit
i l’error analític ha de ser conegut.
Font: adaptació de Andersen 2013, a partir de Spencer et al. 2008; Jenab et al. 2009; Manach et al. 2009.
de mesures objectives a través de biomarcadors, tant d’exposició com d’efecte, d’aquests
productes (Richardson et al. 2003; AbuMweis et al. 2010) que permetin obtenir el màxim
grau d’evidència científica. Aquest és un dels plans estratègics de l’Autoritat Europea de
Seguretat Alimentària (EFSA, de l’anglès European Food Safety Authority) (EFSA
2014).
En la investigació de nous marcadors biològics relacionats amb la dieta, la metabolòmica
ha sorgit com una potent eina per al descobriment de nous biomarcadors nutricionals, tant
d’ingesta com d’efecte (Rezzi et al. 2007). La metabolòmica és la ciència que estudia el
metaboloma, és a dir, el conjunt de metabòlits (definits com aquelles molècules intermediàries i productes del metabolisme amb un pes molecular inferior a 1500 Da) presents
en un sistema biològic (cèl·lula, teixit o fluid) (Oliver et al. 1998; Fiehn 2002; Wishart
2008). L’alimentació influeix en dues fraccions del metaboloma humà: i) el metaboloma
6
Figura 1. Nombre de publicacions per any aparegudes a PubMed mitjançant la cerca “metabolomics”.
Interès, Hipòtesis i Objectius
endogen, que inclou tots els metabòlits produïts per l’organisme; i ii) el
metaboloma alimentari, que inclou
tots els metabòlits externs derivats de
l’exposició dietètica (Scalbert et al.
2014). Durant els darrers anys s’ha
produït un important increment en el
nombre de publicacions en aquest
camp (Figura 1). Aquest fet demostra
el creixent interès que s’està dedicant
En verd s'inclou el nombre de publicacions resultants
de la cerca "metabolomics & nutrition" en la mateixa
base de dades.
a aquesta disciplina, així com el potencial que ofereix en la investigació.
Amb la introducció de la metabolò-
mica dins el camp de la investigació en les ciències de la nutrició ha sorgit el concepte de
metabolòmica nutricional, o nutrimetabolòmica, el qual s’ha definit com la disciplina
òmica que estudia com la dieta afecta al conjunt del metaboloma (Zhang et al. 2008).
L’alimentació indueix canvis en el metabolisme de l’organisme, els quals poden ser avaluats mitjançant l’anàlisi dels metabòlits endògens i exògens en biofluids. Aquests metabòlits poden ser utilitzats com a biomarcadors objectius i precisos del consum d’aliments
i/o dels efectes d’una intervenció dietètica. El metaboloma alimentari (també conegut
com a “food metabolome”) inclou el conjunt de tots els metabòlits derivats de la ingesta
d’aliments, la seva absorció, i la seva biotransformació en els teixits o òrgans de l’organisme i per la microbiota (Fardet et al. 2008). En aquest sentit, l’aplicació de l’aproximació metabolòmica s’ha convertit en una nova estratègia en l’obtenció de nous biomarcadors relacionats amb l’avaluació de l’estat nutricional d’un individu, el consum alimentari, les conseqüències biològiques produïdes després d’una intervenció nutricional, o
l’estudi dels mecanismes metabòlics en resposta a la dieta segons un determinat fenotip
metabòlic (Wishart 2008; Manach et al. 2009; Oresic 2009). El “food metabolome” presenta una elevada complexitat i variabilitat, ja que es calcula que els aliments que consumim contenen >25.000 compostos diferents, la gran majoria dels quals patiran diversos
processos metabòlics en l’organisme (Scalbert et al. 2014). Aquesta particular característica converteix al “food metabolome” en una importantíssima font d’informació sobre la
Interès
7
dieta dels individus, la caracterització del qual permetria monitoritzar d’una manera objectiva i precisa els hàbits alimentaris, així com estudiar com els aliments influeixen en
el risc de desenvolupar malalties (Scalbert et al. 2014).
En aquesta Tesi Doctoral es van seleccionar diferents aliments de consum habitual en el
patró alimentari de les poblacions estudiades per explorar les diferències en el metaboloma urinari mitjançant una aproximació metabolòmica no dirigida. Concretament, es va
estudiar l’empremta metabòlica del consum de pa, tant blanc com integral, de nous i fruita
seca, i de cacau. D’aquesta manera, l’aplicació d’una aproximació nutrimetabolòmica no
dirigida en l’estudi de les empremtes metabòliques associades a aquests aliments permetrà proporcionar nous biomarcadors d’exposició dietètica, així com nous coneixements
sobre les potencials rutes metabòliques que es veuen afectades per al seu consum i que
podrien tenir una influència en els efectes sobre la salut que s’han observat en múltiples
estudis.
Hipòtesis
Aquesta Tesi Doctoral presenta las següents hipòtesis de partida:
La metabolòmica ens ofereix una nova aproximació per a la determinació de biomarcadors d’exposició dietètica que ens permetrà observar diferències en els perfils metabòlics
dels individus segons el consum de determinats aliments en una població d’elevat risc
cardiovascular.
El poder predictiu i/o discriminant dels marcadors d'exposició dietètica es replicarà en
estudis amb diferents dissenys (estudis d’intervenció i estudis observacionals).
La combinació dels biomarcadors d’ingesta permetrà obtenir una major precisió en la
classificació dels individus segons el seu consum alimentari en comparació amb els marcadors avaluats de manera individual.
Objectius
L’objectiu principal d’aquest projecte de Tesi Doctoral és contribuir en la identificació
de biomarcadors relacionats amb la ingesta de determinats aliments (marcadors de consum), així com la seva possible associació amb la salut (marcadors d’efecte) en una població d’elevat risc cardiovascular dins d’un marc de patró de Dieta Mediterrània mitjançant l’aplicació d’una estratègia metabolòmica no dirigida HPLC-q-ToF-MS en estudis
nutricionals amb diferents dissenys.
Per a la consecució d’aquest objectiu s’han plantejat els següents objectius específics:
1. Caracteritzar l’empremta metabòlica urinària associada a la ingesta d’aliments
àmpliament consumits en una població d’elevat risc cardiovascular inclosa en estudis nutricionals amb un control de la ingesta dietètica diferenciat.
2. Replicar els biomarcadors d’exposició caracteritzats en assajos clínics controlats
d’intervenció nutricional en una població en condicions de vida lliure sense cap
mena de restricció o modificació dietètica prèvia.
3. Desenvolupar models de predicció que combinin diversos biomarcadors de consum per a la determinació de la ingesta habitual.
4. Comparar la precisió en la distinció entre consumidors i no consumidors dels metabòlits identificats com a marcadors de consum de manera individual versus combinant-los entre ells en forma de models de biomarcadors.
Antecedents Bibliogràfics
Introducció
Els antecedents bibliogràfics que es presenten a continuació s’exposen com a publicacions dutes a terme durant transcurs de l’elaboració de la present Tesi Doctoral. Aquestes
publicacions permeten situar el treball realitzat en el context científic dins el qual es va
desenvolupar.
En primer lloc es presenta l’aplicació de la metabolòmica en el camp de la nutrició amb
l’objectiu d’identificar nous biomarcadors d’ingesta i d’efecte sobre la salut en format de
revisió bibliogràfica titulada “Nutrimetabolomic strategies to develop new biomarkers of
intake and health effects” i publicada a la revista científica internacional “Journal of Agricultural and Food Chemistry” (2012).
Posteriorment, la contextualització científica de la informació referent a les actuals aplicacions i desafiaments dels biomarcadors nutricionals s’aborda en format de capítol de
llibre. Aquesta publicació porta per títol “Nutritional Biomarkers: Applications and Challenges” i s’inclou dins el llibre “Food Intake: Regulation, Assessing and Controlling”,
publicat per l’editorial Nova Science Publishers (2013).
Finalment, s’exposen les evidències científiques existents sobre la modulació dels compostos bioactius del cacau en la malaltia cardiovascular com a exemple de l’àmplia quantitat de bibliografia científica centrada en l’avaluació dels efectes dels diferents components de la dieta sobre la salut humana. Aquesta informació es presenta en format de
revisió bibliogràfica titulada “Cocoa polyphenols and inflammatory markers of cardiovascular disease” i publicada a la revista científica internacional “Nutrients” (2014).
Capítol 01.
Aplicació de la Nutrimetabolòmica en el Descobriment de Biomarcadors d’Ingesta i d’Efecte en la
Salut
Un dels desafiaments més importants en el que s’està enfrontant l’actual recerca en el
camp de la nutrició és l’avaluació precisa de l'estat metabòlic dels individus després del
consum de determinats aliments o patrons dietètics (Bingham 2002; Jenab et al. 2009).
Recentment, la metabolòmica s'ha proposat com una eina per explorar la complexa relació
entre la nutrició i la salut (Rezzi et al. 2007). La metabolòmica nutricional (també coneguda mitjançant el terme nutrimetabolòmica, o nutrimetabolomics en anglès), a través de
la investigació de la funció que exerceixen els components de la dieta en el manteniment
de la salut i el desenvolupament de processos patològics, té com a objectiu identificar
nous biomarcadors que permetin monitoritzar la ingesta d'aquests compostos, així com
relacionar la dieta amb diferents processos fisiopatològics (Zhang et al. 2008).
La informació respecte l’aplicació de les estratègies nutrimetabolòmiques en el descobriment de nous biomarcadors en la investigació nutricional es presenta en format de revisió
bibliogràfica publicada en una revista científica internacional indexada en el Journal Citation Reports amb un índex d’impacte de 2,906 (2012) i situada en el primer lloc de la
categoria Agriculture, Multidisciplinary (1 de 57) i en el primer quartil de les categories
Food Science & Technology (15 de 124) i Chemistry, Applied (12 de 71):
Rafael Llorach*, Mar Garcia-Aloy*, Sara Tulipani, Rosa Vazquez-Fresno, Cristina
Andres-Lacueva. Nutrimetabolomic strategies to develop new biomarkers of intake
and health effects. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2012;60(36):87978808. doi: 10.1021/jf301142b. *Igual contribució
18
Antecedents Bibliogràfics
En aquesta revisió bibliogràfica es proposa classificar els estudis nutrimetabolòmics segons tres aproximacions diferents utilitzades en el desenvolupament de biomarcadors nutricionals (Figura 1.1): (1) avaluació de les intervencions nutricionals i dietètiques; (2)
monitorització de l’exposició dietètica i consum alimentari; i (3) estratificació dels individus segons fenotips de salut i impacte metabòlic de la dieta. D’aquesta manera, es presenten diversos exemples de cadascuna d'aquestes aplicacions que es poden utilitzar per
proporcionar evidència i es discuteixen els avantatges i les limitacions de cadascuna
d'aquestes estratègies nutrimetabolòmiques.
Figura 1.1. Aproximacions proposades en l’aplicació de la metabolòmica en el camp de la
recerca en ciències de la nutrició.
Capítol 01. Aplicació de la nutrimetabolòmica en el descobriment de biomarcadors
19
20
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 01. Aplicació de la nutrimetabolòmica en el descobriment de biomarcadors
21
22
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 01. Aplicació de la nutrimetabolòmica en el descobriment de biomarcadors
23
24
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 01. Aplicació de la nutrimetabolòmica en el descobriment de biomarcadors
25
26
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 01. Aplicació de la nutrimetabolòmica en el descobriment de biomarcadors
27
28
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 01. Aplicació de la nutrimetabolòmica en el descobriment de biomarcadors
29
30
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02.
Biomarcadors Nutricionals
Un dels principals reptes de l’actual recerca en el camp de la nutrició és millorar la salut
a través d’intervencions dietètiques mitjançant la prevenció, demora o reducció de la gravetat de les malalties cròniques. Per a l’estudi de la relació entre l’alimentació i l’estat de
salut, els biomarcadors s’han proposat com a instruments de mesura precisos que podrien
permetre identificar els mecanismes pels quals els components bioactius de la dieta interactuen amb l’organisme (Jenab et al. 2009). Com s’ha comentat anteriorment, un biomarcador nutricional és aquell compost biològic que es comporta com un indicador de
l’estat nutricional respecte a la ingesta o al metabolisme dels components de la dieta, així
com dels efectes de la ingesta alimentària sobre l’organisme (Potischman i Freudenheim
2003), i que idealment hauria de ser precís, específic, sensible i aplicable a una gran diversitat de poblacions (Jenab et al. 2009). D’aquesta manera, el descobriment de nous
biomarcadors nutricionals permetria avaluar objectivament l'efecte de la dieta en la salut,
així com comprovar el compliment de les recomanacions dietètiques i dels patrons d'alimentació saludables. Addicionalment, el desenvolupament de nous biomarcadors nutricionals robustos podria ajudar a millorar l'estratificació en el risc de presentar una determinada malaltia mitjançant l’optimització de la caracterització del fenotip metabòlic a
nivell individual (Manach et al. 2009). El descobriment i l'avaluació dels biomarcadors
nutricionals depenen en gran mesura de la utilització de les eines analítiques adequades.
Els recents avenços tecnològics i informàtics han millorat la capacitat de detecció de les
tècniques instrumentals habitualment utilitzades en la investigació nutricional. A continuació es discuteixen les principals estratègies utilitzades en l’anàlisi de biomarcadors
nutricionals dins el següent capítol de llibre:
María del Pilar Trespalacios, Sara Tulipani, Mar Garcia-Aloy, Raul ZamoraRos, Maria Rotchés-Ribalta, Montserrat Rabassa, Mireia Urpi-Sarda, María
Boto, Rosa Vázquez, Rafael Llorach, Cristina Andrés-Lacueva. Nutritional
32
Antecedents Bibliogràfics
Biomarkers: Applications and Challenges. A: Morrisson JL (editor). Food
Intake: Regulation, Assessing and Controlling. Nova Science Publishers,
Inc.; 2013. ISBN: 978-1-61324-183-7.
També es presenten exemples de l’aplicació de la metabolòmica en la investigació nutricional per al descobriment de biomarcadors i s'analitzen els principals factors que afecten
la utilitat d'un biomarcador en reflectir adequadament les exposicions dietètiques.
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
33
34
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
35
36
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
37
38
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
39
40
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
41
42
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
43
44
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
45
46
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
47
48
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
49
50
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
51
52
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
53
54
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
55
56
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
57
58
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
59
60
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
61
62
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 02. Biomarcadors nutricionals
63
64
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03.
Consum de Cacau i Malaltia Cardiovascular:
Exemple dels Efectes dels Components de la
Dieta en la Salut
La dieta posseeix un important paper enfront un elevat nombre de malalties de gran prevalença actual (Stampfer et al. 2000; Hu et al. 2001; McCullough et al. 2011). Nombrosos
estudis epidemiològics han demostrat que la ingesta d’aliments d’origen vegetal està associada a un efecte beneficiós en la reducció del risc de malaltia cardiovascular (Dauchet
et al. 2010; He et al. 2010). Com a exemple d’aquestes associacions, a continuació es
presenten les darreres evidències existents en la bibliografia científica respecte al paper
del cacau en la malaltia cardiovascular. La potencial activitat biològica del cacau i dels
seus components polifenòlics en la modulació de la salut cardiovascular està sent àmpliament estudiada i el nombre d’evidències existents al respecte segueix creixent de manera
ràpida (Jia et al. 2010; Hooper et al. 2012; Ried et al. 2012). L’elevat contingut en polifenols del cacau és d’interès particular des dels punts de vista nutricional i farmacològic.
Els polifenols del cacau han demostrat posseir propietats beneficioses enfront la salut
cardiovascular, a més de poder tenir un important paper en la modulació de diversos marcadors inflamatoris implicats en l’aterosclerosi (Rein et al. 2000; Richelle et al. 2001;
Osakabe et al. 2002; Schroeter et al. 2006). L’evidència acumulada sobre els efectes antiinflamatoris dels polifenols del cacau es resumeix en format de revisió bibliogràfica publicada en una revista internacional indexada en el Journal Citation Reports amb un índex
d’impacte de 2,072 i situada en el tercer quartil de la categoria Nutrition & Dietetics (41
de 76):
Nasiruddin Khan, Olha Khymenets, Mireia Urpí-Sardà, Sara Tulipani, Mar GarciaAloy, María Monagas, Ximena Mora-Cubillos, Rafael Llorach, Cristina Andrés-
66
Antecedents Bibliogràfics
Lacueva. Cocoa polyphenols and inflammatory markers of cardiovascular disease.
Nutrients. 2014;6(2):844-880. doi: 10.3390/nu6020844.
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
67
68
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
69
70
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
71
72
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
73
74
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
75
76
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
77
78
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
79
80
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
81
82
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
83
84
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
85
86
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
87
88
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
89
90
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
91
92
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
93
94
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
95
96
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
97
98
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
99
100
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
101
102
Antecedents Bibliogràfics
Capítol 03. Consum de cacau i malaltia cardiovascular
103
Metodologia
Capítol 04.
Disseny dels Estudis Nutricionals
Els anàlisis nutrimetabolomics duts a terme en aquest treball s’han desenvolupat dins del
marc de tres assajos clínics d’intervenció nutricional, un dels quals s’ha utilitzat com a
cohort per a l’estudi dels biomarcadors en condicions de vida lliure sense cap mena de
restricció ni modificació dels hàbits alimentaris habituals dels individus inclosos. A continuació es detallen els dissenys de cadascun d’aquests estudis.
4.1. Estudis d’intervenció
4.1.1. Estudi d’intervenció en humans amb un consum regular de fruita
seca
Es tracta d’un estudi d’intervenció nutricional controlat, aleatoritzat i paral·lel de 12 setmanes de duració dissenyat amb l’objectiu d’avaluar l’efecte d’una dieta suplementada
amb fruita seca en comparació a una dieta control sobre els marcadors d’inflamació i
d’estrès oxidatiu en pacients amb síndrome metabòlica (Lopez-Uriarte et al. 2010; CasasAgustench et al. 2011). El disseny de l’estudi està esquematitzat en la Figura 4.1.
És en un estudi realitzat en col·laboració amb la Unitat de Nutrició Humana de la Facultat
de Medicina i Ciències de la Salut de la Universitat Rovira i Virgili (Dr. Jordi SalasSalvadó i Dra. Mònica Bulló) i finançat pel projecte CONSOLIDER FUN-C-FOOD
(CSD2007-063). Aquest estudi està registrat en el Current Controlled Trials de Londres,
amb el Número Estàndard Internacional d’Assaig Clínic Controlat i Aleatoritzat (ISRCTN, de l’anglès International Standard Randomized Controlled Trial Number) ISRCTN36468613. El protocol d’investigació va ser aprovat pel Comitè d’Ètica de l’Hospital Universitari Sant Joan de Reus, i tots els participants van donar el seu consentiment
per a participar en l’estudi.
108
Metodologia
Figura 4.1. Disseny de l’estudi d’intervenció en humans amb un consum regular de fruita
seca.
4.1.1.1. Característiques dels individus
En aquest estudi es van incloure homes i dones amb síndrome metabòlica que tenien una
edat compresa entre els 18 i els 65 anys. Per al diagnòstic de la síndrome metabòlica els
individus havien de presentar un mínim de tres dels cinc components diagnòstics proposats per al grup d’experts del NCEP-ATPIII (Grundy 2005). A continuació es detalla cadascun dels components:

Circumferència de la cintura ≥102 cm en homes i ≥88 cm en dones.

Triglicèrids ≥150 mg/dL (1,7 mmol/L), o rebre tractament farmacològic per a la
hipertrigliceridèmia.

Colesterol HDL <40 mg/dL (0,9 mmol/L) en homes i <50 mg/dL (1,1 mmol/L)
en dones, o rebre tractament farmacològic per augmentar el c-HDL.

Pressió arterial sistòlica ≥130 mmHg o pressió arterial diastòlica ≥85 mmHg, o
rebre tractament farmacològic antihipertensiu.

Glucosa en dejú ≥100 mg/dL, o rebre tractament farmacològic per al manteniment
dels nivells de glucosa en sang.
Capítol 04. Disseny dels estudis nutricionals
109
Els criteris d’exclusió per a participar en aquest estudi van ser:

Índex de massa corporal (IMC) >35 kg/m2.

Al·lèrgia al consum de fruita seca.

Presència de diabetis mellitus tipus 2 amb o sense tractament farmacològic.

Presència d’alguna malaltia inflamatòria, infecciosa, pulmonar obstructiva, neoplàsica, endocrina o hematològica activa, o bé algun procés infecciós agut o crònic.

Presentar leucocitosi a l’inici de l’estudi (leucòcits >10.000 cèl·lules x 106).

Haver rebut tractament farmacològic antiinflamatori, corticoides, hormones o antibiòtics durant la setmana prèvia a l’inici de l’estudi.

Presència d’enolisme o drogodependència activa, excloent el tabaquisme.

Haver seguit una dieta molt restrictiva durant els 3 mesos anteriors a l’inici de
l’estudi o una pèrdua de pes corporal superior als 5 kg en els darrers 3 mesos.
4.1.1.2. Dietes d’intervenció
Els participants inclosos en l’estudi es van estratificar per gènere i edat (<50 anys i ≥50
anys) i posteriorment es van aleatoritzar per seguir una de les dues dietes d’intervenció
dissenyades:
a) Grup control. Els individus assignats en aquest grup van rebre recomanacions
dietètiques per a seguir una dieta càrdio-saludable en base a les recomanacions de
l’Associació Americana del Cor (AHA, de l’anglès American Heart Association)
(Krauss et al. 2000). A més a més, a tots ells se’ls va remarcar especialment que
no consumissin cap tipus de fruita seca o cacauet durant el període de l’estudi.
b) Grup fruita seca. Els individus van rebre les mateixes recomanacions dietètiques
del grup control, però addicionalment se’ls va suplementar diàriament amb 30
grams d’una mescla de fruita seca (15 grams de nous + 7,5 grams d’ametlles + 7,5
grams d’avellanes) que se’ls van proporcionar gratuïtament.
Les recomanacions de dieta càrdio-saludable que van rebre tots els participants inclosos
a l’estudi es basaven en la reducció del consum de qualsevol tipus de greix, a més d’un
110
Metodologia
elevat consum de fruites i verdures; preferir el consum de cereals sencers i productes
alimentaris lliures de greix o amb un baix contingut en greix; consumir peix almenys dues
vegades a la setmana; limitar el consum de carns vermelles, seleccionant en el seu lloc
carns blanques; limitar el consum de greixos trans i/o saturats i colesterol, així com aliments que continguin olis vegetals parcialment hidrogenats, begudes ensucrades i aliments amb sucre afegit; seleccionar i preparar aliments amb poca o sense sal afegida; i
reduir el consum d’alcohol.
Durant les entrevistes personals que es van fer a l’inici i cada quatre setmanes (Figura
4.1) es va proporcionar consell nutricional a tots els participants amb l’objectiu de millorar el seguiment i l’adherència a les recomanacions dietètiques indicades. Addicionalment, es va recomanar a tots els participants que no canviessin el seu patró habitual d’activitat física, ni tampoc l’hàbit tabàquic, en cas de ser fumadors.
4.1.1.3. Qüestionaris, mesures i recollida de mostres
Tant a l’inici de l’estudi, com en la quarta, vuitena i última setmana d’intervenció els
participants havien d’acudir al centre d’atenció primària en dejú. Durant aquestes visites
se’ls va mesurar el pes, l’alçada (només en la visita basal) i la circumferència de la cintura;
se’ls va determinar la pressió arterial; i es va estimar el seu nivell d’activitat física. Addicionalment, els individus van recollir l’orina excretada durant les 24 hores prèvies a la
visita inicial i a la visita final, la qual es va emmagatzemar a -80ºC fins al moment del
seu anàlisis.
Avaluació de la ingesta dietètica
Es va avaluar mitjançant un registre alimentari de 3 dies (2 dies laborables i 1 dia festiu)
que cada participant completava seguint les indicacions proporcionades durant les visites,
en les que els registres dietètics eren revisats per part de les dietistes juntament amb el
participant. Posteriorment, les dades d’ingesta energètica total i de nutrients es van calcular mitjançant taules nacionals de composició d’aliments (Mataix Verdú 2003).
Capítol 04. Disseny dels estudis nutricionals
111
4.1.2. Estudi d’intervenció en humans amb un consum regular de cacau
en pols
Aquest és un assaig clínic d’intervenció nutricional controlat, aleatoritzat i creuat, l’objectiu principal del qual va ser, per una banda, avaluar l’impacte del consum regular de
solubles de cacau en els marcadors inflamatoris implicats en l’aterosclerosi (Monagas et
al. 2009) i, per l’altra, estudiar la biodisponibilitat dels metabòlits dels polifenols del cacau (Urpi-Sarda et al. 2009) en individus amb risc cardiovascular (Figura 4.2).
Figura 4.2. Disseny de l’estudi d’intervenció en humans amb un consum regular de cacau
en pols.
És en un estudi realitzat en el marc del projecte AGL2004-08378-C02-01 “Biodisponibilitat en humans dels metabòlits dels polifenols presents en els solubles de cacau: efecte
de la microbiota intestinal després de la ingesta aguda i crònica de cacau”, coordinat en
col·laboració entre la Universitat de Barcelona i la Fundació Clínic. Aquest estudi està
registrat en el Current Controlled Trials de Londres, amb el ISRCTN75176807. El protocol d’investigació va ser aprovat pel Comitè d’Ètica de l’Hospital Clínic de Barcelona,
i tots els participants van donar el seu consentiment per a participar en l’estudi.
4.1.2.1. Característiques dels individus
En aquest estudi es van incloure homes i dones amb una edat superior als 55 anys que
presentessin almenys algun dels següents criteris:
1. Diabetis Mellitus (glucèmia ≥126 mg/dL).
2. Presentar ≥3 dels següents factors de risc per a la malaltia cardiovascular:
112
Metodologia

Tabaquisme actiu.

Hipertensió arterial (≥140/90 mmHg).

Colesterol LDL ≥160 mg/dL.

Colesterol HDL ≤35 mg/dL.

Sobrepès o obesitat (IMC ≥25 kg/m2).

Història familiar de malaltia cardiovascular prematura.
Els criteris d’exclusió per a participar en aquest estudi van ser:

Història prèvia de malaltia cardiovascular (cardiopatia isquèmica, accident vascular
cerebral o valvulopatia perifèrica).

Impossibilitat de seguir una dieta controlada o de poder empassar els aliments (per
exemple, trastorns de la deglució).

Impossibilitat de poder assistir als controls.

Antecedents d’hipersensibilitat o reaccions al·lèrgiques a algun component del cacau.

Malaltia mèdica greu que limiti la capacitat de l’individu a la participació en un
estudi d’intervenció dietètica (per exemple, malalties gastrointestinals, neurològiques, psiquiàtriques, endocrines, descompensades o tumorals).

Malalts immunodeprimits o amb infecció per el virus de la immunodeficiència humana (VIH).

Malalts alcohòlics crònics o addictes a drogues.
4.1.2.2. Dietes d’intervenció
Els participants seleccionats van rebre dues intervencions precedides i separades per un
període de dues setmanes (període de rentat), en el qual els individus havien de seguir la
seva dieta habitual excloent els aliments derivats del cacau o que presentaven un elevat
contingut en polifenols. A més a més, l’ordre de les intervencions es va assignar de manera aleatòria. Les intervencions consistien en:
Capítol 04. Disseny dels estudis nutricionals
113
a) Grup control. Els individus assignats en aquest grup van rebre 500 mL diaris de
llet desnatada (Lactalis, Barcelona, Espanya).
b) Grup cacau. Als individus assignats en aquest grup se’ls van administrar 20 grams
de cacau en pols (Nutrexpa, Barcelona, Espanya) dissolts en 250 mL de llet desnatada (Lactalis, Barcelona, Espanya) dos cops al dia (per esmorzar i per berenar),
és a dir, un total de 40 grams de cacau diaris dissolts en 500 mL de llet.
Tots els participants inclosos en l’estudi van seguir una dieta isocalòrica. També se’ls van
excloure tots els aliments que contenien cacau i se’ls va limitar la ingesta d’aliments amb
un elevat contingut en polifenols, com l’oli d’oliva verge, el vi negre, el te, la fruita i les
verdures.
4.1.2.3. Qüestionaris, mesures i recollida de mostres
Tant a l’inici de l’estudi, com després de cada intervenció, els participants havien d’acudir
al centre per a poder-los realitzar mesures antropomètriques, de pressió arterial i fer-los
una extracció sanguínia. Addicionalment, els individus van recollir l’orina de 24 hores
corresponent al dia previ de cada visita, la qual es va emmagatzemar a -80ºC fins al moment del seu anàlisis (Figura 4.2).
Avaluació de la ingesta dietètica
Amb l’objectiu d’avaluar la ingesta energètica i de nutrients, així com de monitoritzar
l’adherència a la intervenció, a l’inici de l’estudi i després de cada període d’intervenció
es va utilitzar un registre alimentari de 3 dies (2 dies laborables i 1 dia festiu) prèviament
validat per a aquest tipus de població (Schroder et al. 2001). Posteriorment, les dades
d’ingesta energètica total i de nutrients es van calcular mitjançant el programa informàtic
“Professional Diet Balancer” (Cardinal Health Systems Inc, Minnesota, Estats Units
d’Amèrica).
114
Metodologia
4.2. Estudi observacional
L’estudi PREDIMED (http://www.predimed.es) és un assaig clínic aleatoritzat i multicèntric d’intervenció dietètica que té com a principal objectiu l’avaluació dels efectes de
la Dieta Mediterrània en la prevenció primària de la malaltia cardiovascular en individus
d’elevat risc (Estruch et al. 2013). Aquest assaig clínic està registrat en el Current Controlled Trials de Londres, amb el ISRCTN35739639. El protocol d’aquest assaig clínic
s’ajusta a la Declaració de Helsinki i va ser aprovat per als Comitès d’Ètica de cadascun
dels centres participants (Martinez-Gonzalez et al. 2012). Addicionalment, tots els participants van entregar el corresponent consentiment informat en el moment de la seva inclusió a l’estudi.
Per a la consecució dels objectius d’aquesta Tesi Doctoral es van utilitzar les mostres del
moment de la inclusió dels participants a l’estudi PREDIMED (temps basal), abans de
l’inici de la intervenció dietètica. Es van considerar dos subconjunts de mostres de participants amb orígens geogràfics diversos. L’anàlisi experimental per LC-MS es va dur a
terme en períodes de temps diferenciats. El primer subconjunt està format per 275 individus dels nodes Hospital Clínic de Barcelona, València i Navarra (S1), mentre que per
al segon subconjunt es van incloure les mostres d’un total de 327 participants dels nodes
Hospital Clínic de Barcelona i València (S2).
El disseny d’aquest estudi metabolòmic correspon al projecte AGL2009-13906-C0201/02 “Desenvolupament de biomarcadors de consum i d'efecte d'un patró d'alimentació
Mediterrània en la prevenció de la malaltia cardiovascular: una aproximació metabolòmica”, coordinat en col·laboració entre la Universitat de Barcelona i la Fundació Clínic.
4.2.1. Característiques dels individus
Els participants de l’estudi PREDIMED eren homes amb edats compreses entre els 55 i
80 anys i dones des dels 60 fins als 80 anys. Cap dels participants presentava malaltia
cardiovascular diagnosticada i havien de presentar almenys algun dels següents criteris:
1. Diabetis Mellitus tipus 2, definida per una glucèmia basal ≥126 mg/dL; glucèmia
casual ≥200 mg/dL amb símptomes de diabetis; glucèmia després d’un test de
tolerància oral a la glucosa ≥200 mg/dL en dues determinacions; o tractament amb
insulina o hipoglucemiants orals.
Capítol 04. Disseny dels estudis nutricionals
115
2. Presentar ≥3 dels principals factors de risc cardiovascular:

Tabaquisme (>1 cigarreta/dia durant el mes anterior a la inclusió).

Hipertensió arterial (pressió arterial sistòlica ≥140 mmHg o pressió arterial diastòlica ≥90 mmHg, o tractament amb agents antihipertensius).

Hipercolesterolèmia (colesterol LDL ≥160 mg/dL o tractament hipolipemiant).

Baixos nivells de colesterol HDL (≤40 mg/dL en homes o ≤50 mg/dL en
dones).

Sobrepès o obesitat (IMC ≥25 kg/m2).

Història familiar de malaltia cardiovascular prematura (familiars de primer
ordre homes <55 anys o dones <65 anys).
Es van excloure aquells individus que presentaven algun dels següents criteris:

Història prèvia de malaltia cardiovascular (malaltia coronària, accident vascular
cerebral o arteriopatia perifèrica).

Malaltia crònica greu.

Immunodeficiència o infecció pel VIH.

Abús de drogues o alcoholisme crònic.

Antecedents d’hipersensibilitat o al·lèrgia a l’oli d’oliva o a la fruita seca.

Baixa predisposició per a canviar els hàbits dietètics, segons els estadis de disposició al canvi del model de Prochaska i DiClemente (Nigg et al. 1999).
4.2.2. Qüestionaris, mesures i recollida de mostres
En la visita basal de l’estudi els participants havien d’acudir al centre en dejú. Se’ls va
mesurar el pes i l’alçada, se’ls va determinar la pressió arterial, se’ls va recollir una mostra
d’orina, se’ls va practicar una extracció sanguínia i se’ls van administrar els següents
qüestionaris: 1) Qüestionari general; 2) Qüestionari de freqüència de consum d’aliments;
2) Qüestionari de 14 punts d’adherència a la Dieta Mediterrània; i 4) Qüestionari d’activitat física. A continuació s’amplia la informació amb més detall dels qüestionaris i altres
mesures que s’han utilitzat en els estudis inclosos en la present Tesi Doctoral.
116
Metodologia
Qüestionaris
El qüestionari general presentava 47 ítems que incloïen informació sobre variables sòciodemogràfiques, la medicació actual i els factors de risc. El qüestionari de freqüència de
consum d’aliments (Figura 4.3) es caracteritza per ser un qüestionari semi-quantitatiu de
137 ítems prèviament validat a Espanya (Martin-Moreno et al. 1993), del que, a més,
també s’ha realitzat una validació amb individus de característiques similars als participants de l’estudi PREDIMED (Fernandez-Ballart et al. 2010) i s’ha confirmat la seva
reproductibilitat (Ortiz-Andrellucchi et al. 2009).
Mesures antropomètriques
El pes i l’alçada es van registrar amb l’individu amb roba lleugera i sense sabates utilitzant
una balança i un estadiòmetre, respectivament, prèviament calibrats. Una vegada mesurats ambdós paràmetres, a partir d’ells es va calcular l’IMC: IMC (kg/m 2) = Pes (kg) /
Talla2 (m2).
Recollida i emmagatzemament de mostres biològiques
Es va recollir una mostra d’orina de primera hora del matí en condicions de dejú, la qual
es va aliquotar, codificar i emmagatzemar a -80ºC fins al moment del seu anàlisis.
Capítol 04. Disseny dels estudis nutricionals
Figura 4.3. Qüestionari de freqüència de consum d’aliments
117
118
Figura 4.3. (Continuació)
Metodologia
Capítol 04. Disseny dels estudis nutricionals
Figura 4.3. (Continuació)
119
120
Figura 4.3. (Continuació)
Metodologia
Capítol 05.
Anàlisi Metabolòmic No Dirigit per HPLC-q-ToF-MS
El procés d’estudi del metaboloma desenvolupat per al descobriment de nous biomarcadors nutricionals s’ha dut a terme d’acord l’experiència prèvia del grup d’investigació
(Llorach et al. 2009; Llorach et al. 2010; Llorach-Asuncion et al. 2010) (http://www.nutrimetabolomics.com) seguint les recomanacions de la Metabolomics Society
(http://www.metabolomicssociety.org) i de la European Nutrigenomics Organisation
(NuGO). Els estudis metabolòmics segueixen un determinat protocol metodològic que
inclou les següents fases: i) preparació de les mostres biològiques; ii) adquisició de dades;
iii) anàlisi de dades; iv) identificació dels metabòlits discriminants (biomarcadors); i v)
interpretació biològica. La Figura 5.1 presenta el diagrama general del protocol de treball
en metabolòmica que s’ha seguit en la present Tesi Doctoral. En les properes seccions
d’aquest capítol es descriuen de forma detallada els aspectes corresponents a cadascuna
de les fases que formen part del protocol de treball per a l’estudi del metaboloma urinari.
Figura 5.1. Procés d’estudi del metaboloma urinari
122
Metodologia
5.1. Preparació de la mostra d’orina
Degut a que en les investigacions metabolòmiques no dirigides es pretén detectar el màxim nombre de metabòlits en les mostres analitzades, el procés de preparació ha de ser el
més senzill possible a fi de conservar el seu estat biològic original (Dettmer et al. 2007).
Les mostres d’orina que han de ser analitzades mitjançant una aproximació metabolòmica
no dirigida utilitzant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS,
de l’anglès Liquid-Chromatography coupled to Mass Spectrometry) no requereixen de
cap tipus de tractament especial, excepte la centrifugació i dilució amb la finalitat de protegir el sistema LC-MS (Theodoridis et al. 2012). També cal tenir en compte que durant
el procés analític i mentre les mostres es troben en cua per a poder ser analitzades, es
recomana que mantinguin una temperatura d’entre 0ºC i 4ºC (Gika et al. 2008).
Considerant tots aquests aspectes, les mostres d’orina es van descongelar gradualment a
4ºC dins de frigorífic. Posteriorment, es van centrifugar a 12.000 rpm durant 5 minuts i a
una temperatura de 4ºC. El sobrenadant va ser diluït 1:1 amb aigua purificada (Milli-Q).
L’aigua Milli-Q es va obtenir d’un sistema de purificació Milli-Q Gradient A10 (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, Estats Units d’Amèrica). Finalment, les mostres es van vortexar i traslladar en plaques de 96 pouets per al seu anàlisi.
5.2. Adquisició de dades: anàlisi HPLC-q-ToF-MS
Degut a l’àmplia diversitat de metabòlits presents en les mostres biològiques, actualment
no és possible detectar totes les classes de compostos amb un únic mètode analític. Per
aquest motiu són diverses les tècniques i equips utilitzats en l’adquisició de dades en
estudis metabolòmics no dirigits. La plataforma utilitzada en aquesta Tesi Doctoral és la
cromatografia líquida d’alta resolució acoblada a espectrometria de masses amb analitzador híbrid quadrupol-temps de vol (HPLC-q-ToF-MS, de l’anglès High-Performance Liquid Chromatography coupled to quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry), pel que
a continuació es descriuran els principis bàsics d’aquesta tècnica analítica. L’anàlisi
HPLC-q-ToF-MS es va realitzar utilitzant un sistema Agilent HPLC sèrie 1200 RRLC
acoblat a un sistema híbrid quadrupol temps-de-vol QSTAR Elite (AB Sciex) equipat
amb una font d’ionització de tipus electroesprai (ESI, de l’anglès Electrospray Ionization).
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
123
La cromatografia és una tècnica de separació on els components d’una mostra se separen
en funció de l’afinitat que aquests presenten en sistemes de dues fases, que consisteixen
en una fase mòbil i una fase estacionària. La mostra és dissolta en la fase mòbil, la qual
s’encarrega de transportar la mostra a través de la fase estacionària situada dins una columna, l’objectiu de la qual és retardar el pas dels components de la mostra d’acord amb
la seva polaritat. El temps de retenció (RT, de l’anglès Retention Time) mesura el temps
que cada compost necessita per eluir a través de la columna, el qual ajuda en la seva
identificació. La cromatografia de fase reversa, que és el tipus utilitzat en els estudis inclosos en aquest treball, consisteix en una fase estacionària apolar i una fase mòbil polar,
de manera que les molècules de naturalesa polar elueixen més ràpidament en comparació
a les de caràcter apolar, les quals són retingudes en la columna durant més temps.
D’aquesta manera, la separació cromatogràfica proporciona un coneixement molt eficient
sobre la polaritat de les molècules detectades (Dunn et al. 2013). La Figura 5.2 mostra
una representació esquemàtica de la separació cromatogràfica. Posteriorment, les molècules s’ionitzen i s’introdueixen en l’espectròmetre de masses, on es mesura la seva relació massa-carga (m/z) i la intensitat (recompte d’ions).
Per a la separació cromatogràfica es van injectar 15µL de la mostra preparada utilitzant
un auto-injector termostatitzat a 4ºC en una columna de fase reversa model Luna® C18(2)
amb una mida de partícula de 5µm i amb unes dimensions de 50 x 2,0 mm (Phenomenex,
Torrance; Califòrnia, Estats Units d’Amèrica). El flux de la cromatografia va ser de 600
µL/min. La fase mòbil estava composta per: fase A) 0,1% d’àcid fòrmic (Sigma-Aldrich;
Saint Louis, Missouri, Estats Units d’Amèrica) en aigua Milli-Q; i fase B) 0,1% d’àcid
fòrmic en acetonitril (Sigma-Aldrich). Per a la separació es va utilitzar un gradient lineal
amb les següents proporcions (v/v) de fase B (expressat com a temps, minuts; % fase B):
(0, 1), (4, 20), (6, 95), (7,5, 95), (8, 1) i (12, 1).
Figura 5.2. Representació esquemàtica del mètode de separació cromatogràfica.
Font: adaptació a partir de Stanstrup 2014.
124
Metodologia
L’espectrometria de masses és una de les tècniques més efectives en l’anàlisi metabolòmic no dirigit de mostres biològiques degut a la seva elevada sensibilitat i senzilla combinació amb tècniques cromatogràfiques, fet que possibilita la identificació dels compostos (Theodoridis et al. 2012). Aquesta tècnica permet mesurar els ions de les molècules
en funció de la seva relació massa-càrrega (m/z). Les principals parts d’un espectròmetre
de masses consisteixen en: i) una font d’ionització; ii) un analitzador de masses; i iii) un
detector (Figura 5.3).
A mesura que els compostos de la mostra elueixen des del sistema cromatogràfic, aquests
es van injectant a la font d’ionització, que és on les molècules s’ionitzen. En metabolòmica es poden emprar diverses fonts d’ionització, sent la ionització ESI la més utilitzada
(Dettmer et al. 2007; Theodoridis et al. 2012; Dunn et al. 2013). Durant la ESI, la mostra
dissolta en la fase mòbil forma un aerosol de partícules carregades (ionitzades) gràcies a
la creació d’un camp elèctric i a la presència del gas nebulitzador a altes temperatures que
va evaporant el solvent. Els analits s’ionitzen per l’addició o eliminació d’un protó (H+).
D’aquesta manera, l’instrument pot ser operat en mode d’ionització positiu o negatiu.
Amb l’objectiu d’obtenir la màxima cobertura possible del metaboloma es recomana utilitzar ambdós tipus d’ionització (Dettmer et al. 2007).
A continuació, les partícules carregades són aspirades cap a l’entrada de l’analitzador de
masses, el qual separa els ions en funció de la seva relació massa-carga (m/z). Els espectròmetres híbrids quadrupol-temps de vol proporcionen analitzadors de masses quadrupol
i temps-de-vol amb una cel·la de col·lisió intermediària per a la possible fragmentació.
Un analitzador de masses quadrupol consta de quatre cilindres paral·lels disposats de tal
manera que formen un quadrat, als quals se’ls aplica un potencial amb l’objectiu de generar un camp electromagnètic que determina quins ions, segons la seva m/z, podran arribar al detector. Aquest analitzador pot treballar en mode d’escaneig (“full scan”), el qual
analitza totes les m/z que es troben en un determinat interval, o bé seleccionant una m/z
Figura 5.3. Representació esquemàtica del mètode analític per espectrometria de masses.
Font: adaptació a partir de Stanstrup 2014 i Holcapek 2014.
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
125
en concret (“selected ion monitoring”). En les aproximacions metabolòmiques no dirigides el quadrupol opera en mode d’escaneig, mentre que la monitorització de determinades
m/z es reserva per als experiments d’espectrometria de masses en tàndem (MS/MS, Secció 5.4.3.3).
La cel·la de col·lisió es pot utilitzar per fragmentar les molècules, el que és avantatjós per
l’elucidació d’estructures (més informació a la Secció 5.4.3.3).
A continuació, les molècules arriben l’analitzador temps-de-vol. En aquest analitzador
s’aplica una força electromagnètica uniforme a tots els ions al mateix temps, provocant
una acceleració al seu pas. Els ions més lleugers viatgen més ràpid i arriben primer al
detector. La m/z dels ions està relacionada amb el temps de vol, pel que es poden determinar segons el temps d’arribada: els ions amb una m/z més baixa passen pel ToF més
ràpidament i, per tant, són aquells que arriben primer al detector.
Finalment, el detector proporciona informació sobre el flux o abundància dels ions que
surten de l’analitzador de masses.
En els estudis inclosos en aquest treball, l’adquisició de masses es va dur a terme utilitzant
tant la ionització positiva com la ionització negativa en el mode “full scan” que va analitzar un rang de m/z entre 70 i 700. Els paràmetres de l’esprai van ser: IS ± 4000 V, DP
80 V, FP ± 380 V, DP2 ± 10 V, IRD 6, IRW 5, TEM 400ºC amb N2 com a gas cortina
(50 L/min) i nebulitzador (60 L/min). L’equip es va calibrar amb reserpina per al mode
positiu (ions m/z 195.0651 i m/z 609.2812) (1 pmol/μL) i àcid taurocòlic per al mode
negatiu (ions m/z 79.9568 i m/z 514.2844) (1 pmol/μL).
5.2.1. Control de qualitat per a la monitorització d’experiments metabolòmics no dirigits
Amb l’objectiu d’avaluar la qualitat de les dades durant la seva adquisició es van analitzar
les mostres de control de qualitat (QC, de l’anglès Quality Control) al llarg del procés
analític. Es van injectar mostres QC cada 20 mostres, aproximadament, per controlar que
la variació analítica fos mínima, per proporcionar una mesura sobre l’estabilitat i el funcionament del sistema, i per avaluar la qualitat i reproductibilitat de les dades adquirides.
Es van utilitzar 4 tipus diferents de QC i es van injectar 4 conjunts de cadascun d’aquests
QC en cadascuna de les plaques. Els QC varen ser els següents:
126
Metodologia

QC1: mostres d’aigua Milli-Q;

QC2: solució aquosa d’una mescla de compostos fenòlics (5 ng/µL) que va constar d’àcid gàl·lic, àcid siríngic, procianidina B2, (-)-epicatequina (tots de SigmaAldrich), àcid 4-hidroxihipúric (PhytoLab, GmbH & Co.; Alemanya), i naringenina (Extrasynthèse; Genay, França);

QC3: solució aquosa d’una mescla de metabòlits urinaris endògens (5 ng/µL) que
va constar de 1-metil-L-histidina, L-citrul·lina, 2’-deoxiadenosina, L-fenilalanina, 2’-deoxiguanosina, L-triptòfan, i àcid glicoquenodeoxicòlic (tots de SigmaAldrich); i

QC4: re-injecció de mostres d’orina en posicions oposades al llarg de la seqüència
d’anàlisis de la corresponent placa.
Al mateix temps, i per evitar biaixos produïts per a una possible deriva analítica, les plaques van ser equilibrades per a que representessin tota la variabilitat de les mostres a
analitzar. És a dir, les mostres de cada placa presentaven unes característiques similars
[per exemple, en cada placa hi havia pràcticament el mateix nombre d’homes (i dones)].
A més a més, l’ordre d’injecció va ser aleatoritzat per evitar que se solapessin els efectes,
és a dir, no es van injectar primer totes les mostres corresponents a una classe (per exemple, homes) i després les corresponents a l’altra (per exemple, dones), ja que no hi hauria
manera de saber si un metabòlit que fos significatiu per a un grup seria degut a característiques intrínseques de la pròpia classe o perquè hagués pogut succeir algun problema
que únicament hagués afectat a un conjunt de mostres.
Els isòtops fenilalanina 15N i àcid indol-3-acètic-2,2-d2 es van addicionar a les mostres
del subconjunt 2 (S2) per a la valoració de la seva idoneïtat.
5.3. Anàlisi de dades
Els anàlisis metabolòmics produeixen una gran quantitat de dades caracteritzades per matrius que contenen un nombre de variables molt més elevat que de mostres. El processament matemàtic d’aquestes dades es pot dividir en tres etapes principals: i) processament
de dades; ii) transformació de dades; i iii) anàlisis estadístics. En les següents seccions
s’especifiquen els detalls de cadascuna d’aquestes etapes.
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
127
5.3.1. Processament de dades
El processament de les dades obtingudes per LC-MS engloba les transformacions realitzades en les dades “brutes” o “crues” abans de procedir a l’anàlisi estadístic. A causa de
la seva naturalesa tridimensional (temps de retenció, valor m/z i intensitat dels ions),
l’anàlisi estadístic no es pot realitzar directament i, per tant, el processament és un pas
essencial per obtenir una matriu de dades bidimensional, que serà la utilitzada en els
posteriors anàlisis estadístics. La matriu bidimensional consta de parells de RT-m/z que
junts defineixen un marcador (“mass feature” o “feature”) detectat en una dimensió, i les
mostres en l’altra. Per a cada marcador i mostra es calcula la intensitat de l’ió, representada per la integració de l’àrea del corresponent pic. Per això, durant aquesta etapa se sol
procedir a través del filtrat, detecció de pics en les mostres i alineament de pics entre les
diferents mostres (Figura 5.4).
Figura 5.4. Estructura tridimensional de les dades LC-MS “brutes” (esquerra) i estructura bidimensional (dreta) de la base de dades després del processament de dades.
Font: adaptació a partir de Stanstrup 2014.
Els mètodes de filtració processen la senyal mesurada amb l’objectiu d’eliminar el soroll
de base a partir d’establir un determinat llindar (“threshold”).
El propòsit de la detecció de pics és identificar tots els pics cromatogràfics, els quals es
defineixen per al seu RT i el seu valor de m/z. Les àrees sota d’aquests pics s’integren i
es consideren que són proporcionals a la concentració de l’analit. Cadascun del parell RTm/z obtingut és el que es coneix com a marcador (o “feature”), els quals es poden considerar com les variables que defineixen cada mostra. La detecció de pics és realitzada per
cada mostra per separat. Per això, en el següent pas (alineament de pics) cal aparellar tots
els marcadors del mateix ió que apareixen en les diferents mostres.
128
Metodologia
Per a la filtració, detecció i alineament d’ions es va utilitzar el software MarkerView 1.2.1
(AB Sciex; Toronto, Canadà). Els paràmetres aplicats en cada estudi van ser optimitzats
tenint en compte les mostres incloses en cadascun d’ells. Per tant, aquests valors estan
especificats en la secció de material i mètodes de cada publicació. Mitjançant aquest procés es va obtenir una taula d’ions que contenia la massa exacta, el temps de retenció i la
intensitat en les mostres analitzades per a cadascun dels ions. Posteriorment, aquesta taula
va ser objecte dels successius anàlisis estadístics.
5.3.2. Tractament de dades
Abans de procedir al tractament estadístic cal tractar les dades obtingudes en l’etapa anterior d’una manera apropiada. Les dades obtingudes a partir d’una aproximació metabolòmica no dirigida poden presentar diferents fonts de variació a banda de la variació biològica que es vol estudiar. Aquestes variacions es poden deure a: i) diferències en l’ordre
de magnitud entre les intensitats dels ions detectats (els metabòlits que estan a concentracions més elevades no necessàriament han de ser més importants que aquells que es troben en unes concentracions més baixes); ii) diferències en les magnituds dels canvis en
les concentracions dels metabòlits (els metabòlits que formen part del metabolisme primari solen mantenir-se a unes concentracions més constants que aquells que formen part
de les rutes metabòliques del metabolisme secundari); iii) variació biològica no induïda
(sota condicions experimentals idèntiques alguns metabòlits mostren grans fluctuacions
en les seves concentracions); iv) variacions tècniques degudes a la preparació de les mostres o a errors analítics; i v) l’heteroscedasticitat, és a dir, quan la variació de les senyals
no és constant en totes les mostres (van den Berg et al. 2006). Per tant, l’objectiu del
tractament de les dades és focalitzar els posteriors anàlisis estadístics en la informació
biològicament rellevant minimitzant al màxim les altres fonts de variació, a més de procurar obtenir una distribució de les dades més adaptada a la corba de normalitat.
Els procediments que s’engloben dins l’etapa de tractament de dades són la transformació, el centrat i l’escalat. L’objectiu de la transformació és corregir l’heteroscedasticitat
de les dades i incrementar la simetria de la seva distribució, sent la transformació logarítmica la més utilitzada. El centrat converteix totes les fluctuacions de les magnituds dels
ions al voltant de zero, enlloc de que ho facin al voltant de la seva mitjana. Finalment, els
mètodes d’escalat divideixen cada variable (marcador) per un factor (el factor d’escalat),
el qual serà diferent per a cadascuna d’elles (van den Berg et al. 2006). D’aquesta manera,
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
129
l’escalat de les dades permet proporcionar la mateixa importància (pes) a tots els marcadors, independentment de la seva abundància. El mètode d’escalat per Pareto, que és un
dels més comunament emprats en metabolòmica (Trygg et al. 2007), utilitza l’arrel quadrada de la desviació estàndard com a factor d’escalat (van den Berg et al. 2006).
5.3.3. Anàlisis estadístics
Com s’ha comentat anteriorment, les dades obtingudes mitjançant anàlisis metabolòmics
típicament contenen milers d’ions (marcadors) sobre centenars de metabòlits per a cada
mostra. La multidimensionalitat d’aquest tipus de dades és difícil de comprendre i visualitzar amb els mètodes estadístics tradicionals, pel que habitualment s’utilitzen anàlisis
multivariants per extreure la informació més rellevant, ja que tenen capacitat de descompondre dades complexes en estructures més simples i potencialment interpretables (Trygg
et al. 2007). També cal tenir en compte que la informació rellevant que rau en el metaboloma habitualment es troba en un conjunt de metabòlits, ja sigui de manera aïllada en les
magnituds de cadascun d’ells o bé en la relació que hi ha entre els mateixos. Per aquest
motiu es poden dur a terme anàlisis uni- o multivariants. Mentre les aproximacions multivariants es focalitzen en les relacions complementàries que hi ha entre els metabòlits,
els anàlisis univariants es focalitzen en les diferències en les magnituds que hi ha en cadascun dels metabòlits independentment (Saccenti et al. 2014). A continuació es fa una
breu introducció dels principis bàsics dels diferents mètodes estadístics aplicats en la present Tesi Doctoral.
5.3.3.1. Anàlisis multivariants
Els anàlisis multivariants s’utilitzen per obtenir la informació rellevant sobre les diferents
categories o classes de mostres basada en la diferència present en les senyals dels metabòlits, així com en les correlacions que hi ha entre ells (Saccenti et al. 2014). Aquest tipus
d’anàlisi s’utilitza habitualment en metabolòmica ja que, a diferència de les aproximacions univariants, pot gestionar un gran nombre de variables i no requereix que les variables siguin independents. A més a més, cal tenir en compte que molts dels marcadors
detectats a partir dels anàlisis metabolòmics basats en LC-MS sovint estan molt correlacionats entre ells degut a la fragmentació i a la formació d’adductes durant l’anàlisi ex-
130
Metodologia
perimental, així com les associacions biològiques a causa de la detecció de diversos compostos que poden formar part de les mateixes rutes metabòliques (Wold et al. 2001). Addicionalment, l’aproximació multivariant permet explorar els patrons biològics, els quals
poden incloure marcadors que podrien no ser significatius en un anàlisis estadístic univariant (Saccenti et al. 2014).
En els treballs inclosos en aquesta Tesi Doctoral es van realitzar dos tipus d’anàlisis multivariants. Per una banda, es van utilitzar tècniques no supervisades (no tenen en compte
la variabilitat experimental) i, per una altra, tècniques supervisades (utilitzen el coneixement sobre les classes a les que pertanyen les mostres) (Rezzi et al. 2007; Trygg et al.
2007). Els mètodes no supervisats no requereixen cap coneixement previ dels grups o
classes a les que les dades pertanyen i es poden utilitzar per resumir i trobar els marcadors
clau de les dades i el descobriment de classes. En canvi, els mètodes supervisats solen ser
més potents en la cerca de quins són els marcadors que difereixen més entre les classes i
permeten validar la separació entre classes numèricament. Tots els anàlisis multivariants
es van realitzar amb el software SIMCA-P (versió 13.0; Umetrics; Umeå, Suècia).
Anàlisis de components principals (PCA)
L’anàlisi de components principals (PCA, de l’anglès Principal Component Analysis) és
una tècnica no supervisada que té com a objectiu reduir la gran dimensionalitat de les
dades mitjançant la realització de combinacions lineals de les variables originals que estan
correlacionades entre si en un conjunt de variables més petit no correlacionades entre si.
D’aquesta manera, proporciona una visió general de totes les mostres analitzades. Les
noves combinacions lineals de les variables originals són anomenades components principals (PC). Els PC s’ordenen d’acord amb la variància explicada (expressada com a percentatge respecte la variabilitat total). Per tant, el primer PC (PC1) explica la màxima
variància observada (Trygg et al. 2007).
Les dades es visualitzen en gràfics de dispersió anomenats “score plot” i “loading plot”,
on cada punt del “score plot” representa una mostra i cada punt en el “loading plot” representa un marcador (és a dir, una variable identificada per la parella m/z-RT). D’aquesta
manera, la variació sistemàtica és capturada en el gràfic, el qual mostra ràpidament quines
mostres del conjunt de dades són similars o diferents unes amb les altres. Els “score plots”
proporcionen una visualització de les dades que sovint mostra tendències d’agrupaments
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
131
entre les mostres similars, separacions de les diferents classes de mostres, o presència de
mostres “outliers” (atípiques). Una característica important és que les direccions en el
“loading plot” corresponen a direccions en el “score plot” identificant, per exemple, quines variables són les responsables de l’agrupació o de la separació dels diferents grups de
mostres (Trygg et al. 2007). La Figura 5.5 mostra com a exemple el resultat d’un anàlisis
per PCA.
Figura 5.5. Exemple de PCA per l’avaluació dels QCs, així com de mostres “outliers”.
(A) “Score plot” de mostres corresponents a QC de diferents classes (cada color mostra una classe); (B)
“Loading plot” corresponent a la figura A (el color dels cercles en línia discontinua mostra els ions
característics de cada classe); (C) “Score plot” de mostres d’orina, on els colors mostren les plaques
d’injecció durant l’anàlisi, el negre correspon a les mostres analitzades per duplicat (els cercles agrupen
les injeccions que corresponen a la mateixa mostra), mentre que el cercle de línia discontínua indica les
mostres “outliers”.
Els PCA es van utilitzar amb finalitats exploratòries: per estudiar les possibles diferències
entre les mostres de QC d’una mateixa classe; per detectar possibles mostres que es comportessin com “outliers”, és a dir, aquelles mostres que diferien de la majoria; així com
per observar si hi havia variacions relacionades amb les derives analítiques (en el cas que
les mostres se situessin en el “score plot” tenint en compte l’ordre en què es van injectar).
Anàlisis discriminant per mínims quadrats parcials (PLS-DA)
L’anàlisis discriminant per mínims quadrats parcials (PLS-DA, de l’anglès Partial Least
Square Discriminant Analysis) és un anàlisis àmpliament utilitzat que intenta maximitzar
la separació de les observacions (mostres biològiques) pertanyents a les diferents classes
que prèviament han estat definides (per exemple, dieta). Això permet establir un model
que pot predir la classe (variable Y) a partir dels marcadors mesurats en l’anàlisi LC-MS
(variables X). D’aquesta manera, es poden descobrir quins marcadors són els que millor
prediuen el vector classe (Trygg et al. 2007). El percentatge de variació explicada per al
132
Metodologia
model s’indica a través del valor R2, el qual té un rang que varia entre 0 i 1. Per tant,
valors propers a 1 indiquen que el model és capaç de classificar les mostres correctament
en les classes definides.
De la mateixa manera que en el PCA, els resultats es visualitzen en gràfics de dispersió
anomenats “score plot” i “loading plot”, els quals presenten les mateixes característiques
anteriorment especificades.
Anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials ortogonal (OPLS-DA)
L’anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials ortogonal (OPLS-DA, de l’anglès
Orthogonal Partial Least Square Discriminant Analysis) és una variant del PLS-DA que
separa la variació sistemàtica de les variables X en dues parts, una que està linealment
correlacionada amb la variable Y i l’altra que és ortogonal a Y, és a dir, que conté la
variació sistemàtica en X no relacionada amb la separació de les classes. Aquesta separació de la variació en components predictius i ortogonals facilita la interpretació del model,
ja que la variació entre classes es pot interpretar a partir del component predictiu, mentre
que la variació dins de les classes es pot interpretar a partir dels components ortogonals
(Wiklund et al. 2008).
Correcció ortogonal de les senyals (OSC)
Els models PLS-DA es veuen negativament afectats per la variació sistemàtica present en
la matriu X que no està relacionada amb la variable Y. Aquest fet pot comportar alguns
errors en la interpretació i tenir importants implicacions en la selecció dels marcadors
discriminants (Trygg et al. 2007). Considerant que en els estudis desenvolupats amb mostres d’humans en condicions de vida lliure la majoria de les vegades existeixen moltes
fonts de variació diferents a la que s’està estudiant, sol ser necessari aplicar filtres multivariants de pre-processament de les dades abans de procedir amb el PLS-DA (Trygg et
al. 2007; Pujos-Guillot et al. 2013). El filtre utilitzat en els estudis recollits en aquest
treball és el que es centra en la correcció ortogonal de les senyals (OSC, de l’anglès Orthogonal Signal Correction), la qual elimina la informació de les senyals (X) que no està
relacionada amb les classes (Y) (Trygg et al. 2007).
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
133
Estratègies de validació de models
Quan es fan anàlisis de PLS-DA cal avaluar la consistència del model per assegurar que
aquest no està sobreajustat (“overfitted”), ja que, degut a l’elevat nombre de marcadors
detectats durant l’anàlisi LC-MS en comparació al nombre de mostres analitzades, la classificació PLS-DA en alguns casos pot ser deguda a l’atzar. Per tant, el concepte de sobreajust significa que tot i que el model PLS-DA pugui classificar correctament les mostres,
futures mostres que es vulguin classificar segons el model dissenyat no seran assignades
a la classe correcta. Les principals estratègies de validació de models de PLS-DA són les
de validació creuada i les de permutació (Westerhuis et al. 2008).
Per a dur a terme la validació creuada, la matriu de dades es divideix en un grup d’entrenament i un grup de validació. Mitjançant el grup d’entrenament es crea el model, mentre
que l’altre grup serveix per validar-lo. Aquest procediment es repeteix diverses vegades
de manera que totes les mostres hagin format part del grup de validació en una única
ocasió, pel que llavors es considera que l’error de predicció calculat (Q2) serà representatiu per a noves mostres. Així doncs, el valor Q2 indica com de bé es pot predir una classe
a partir de noves dades. El valor de Q2 va des de 0 fins a 1, sent 0 un indicatiu de que el
model no té capacitat predictiva, mentre que com més pròxim sigui aquest valor de 1
millor serà la capacitat del model per predir a quina classe correspon una mostra nova
(Westerhuis et al. 2008).
Les proves de permutació avaluen si la classificació de les mostres en les classes és significativament millor que qualsevol altra classificació deguda a l’atzar de les mateixes
mostres en classes arbitràries (Westerhuis
Figura 5.6. Exemple del gràfic obtingut
després de dur a terme 200 proves de permutació.
et al. 2008). D’aquesta manera, durant la
prova de permutació (que s’efectua de manera repetida durant un determinat nombre
de vegades) es pot calcular un nou model
degut a una classificació aleatòria, mitjançant el qual s’obté un nou valor de R2 i de
Q2, els quals podran ser comparats amb els
del model PLS-DA real que s’està avaluant. Els resultats de les proves de permutació es mostren en un gràfic, a la dreta del
qual s’hi situen els valors R2 i Q2 del model
134
Metodologia
original, mentre que a l’esquerra i en el eix de les ordenades es poden veure aquests mateixos valors per a cadascuna de les permutacions realitzades. En el eix de les abscisses
s’hi indiquen les correlacions entre els valors originals i els valors calculats a partir de les
permutacions. En la Figura 5.6 es mostra un exemple dels resultats d’una prova de permutació.
En els estudis inclosos en aquesta Tesi Doctoral es van realitzar proves de permutació (n
= 200) i de validació creuada de 7 iteracions. D’aquesta manera, el conjunt de les mostres
es va dividir en 7 subconjunts, un dels quals es va considerar com a grup de validació i la
resta com a grup d’entrenament, repetint aquest procés fins a 7 vegades, on en cadascuna
d’elles es va utilitzar un subconjunt de mostres diferent com a grup de validació.
Selecció de les variables discriminants
En una aproximació metabolòmica exploratòria l’objectiu habitualment és identificar i
seleccionar les variables rellevants a partir dels models multivariants. Especialment s’utilitzen mètodes supervisats, on el coneixement a priori sobre la classe a la que cada mostra
pertany és utilitzat per seleccionar les variables que són considerablement diferents entre
els dos grups de mostres i que poden ser nous biomarcadors candidats un cop s’hagin
identificat.
Una forma de seleccionar les variables discriminants entre les dues classes avaluades és
mitjançant la importància de la variable en la projecció (VIP, de l’anglès Variable Importance for Projection). Els valors VIP són una mesura de la contribució que cada variable
té en el model PLS-DA. Per tant, com més gran sigui aquest valor, més rellevant és la
variable en el model. En la majoria d’estudis metabolòmics un valor VIP ≥ 1 es considera
apropiat per a la selecció de les variables discriminants (Bryan et al. 2008). No obstant,
per als estudis inclosos en aquest treball es va utilitzar un punt de tall de VIP ≥ 1,5 amb
l’objectiu de ser més restrictius a l’hora de seleccionar els marcadors i reduir les possibilitats d’obtenir falsos positius.
També es poden utilitzar les gràfiques “S-plot” i “SUS-plot” per a la selecció de les variables que més contribueixen a la separació de les classes (Wiklund et al. 2008; Eriksson
et al. 2013). Els “S-plot” (Figura 5.7a) combinen gràficament el pes (p) que cada marcador presenta dins del model i la correlació entre la variable X i el valor p [p(corr)]. Habitualment aquests gràfics presenten forma de S. D’aquí prové el seu nom. El p(corr) pren
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
135
Figura 5.7. Exemple de “S-plot” i “SUS-plot” per a la selecció de les variables
discriminants.
(A) “S-plot” on hi ha encerclat els ions discriminants segons el valor de p(corr); (B) “SUS-plot” on
s’indiquen els diferents tipus de localitzacions que poden presentar els ions pertanyents als dos models
que s’estan comparant.
valors entre -1 i +1, considerant valors de |p(corr)| ≥ 0,5 com a punt de tall per a la selecció
de les variables més discriminants. El “SUS-plot” (acrònim de l’anglès Shared and Unique Structures) és una extensió del “S-plot” utilitzada quan dues classes diferents es comparen contra una mateixa classe de referència mitjançant la creació de dos models. El
“SUS-plot” (Figura 5.7b) és un diagrama de dispersió del vector p(corr) provinent de
cadascun dels dos models diferents. Si els dos models presenten perfils similars, les variables X se situaran en la diagonal que va des del vèrtex inferior-esquerre fins al vèrtex
superior-dret. Aquestes variables representen l’estructura compartida amb una mateixa
direcció entre els dos models que s’estan comparant. D’altra banda, les variables X que
se situïn en l’altra diagonal representen l’estructura compartida entre els dos models, però
136
Metodologia
amb direccions oposades. Finalment, aquelles variables X que no se situïn en cap d’aquestes dues diagonals (és a dir, en el centre de la banda esquerra, per exemple) representen
l’estructura única de cadascun dels models que s’estan comparant.
5.3.3.2. Anàlisis univariants
Amb l’objectiu de comparar les magnituds mesurades dels ions discriminants es va utilitzar el test estadístic de Kolmogorov-Smirnov per a testar la seva distribució. Per a les
variables que seguien una distribució normal es va utilitzar la prova de la t de Student o
l’anàlisi de la variància (ANOVA, de l’anglès, analysis of variance) d’un factor; mentre
que per a les variables que no seguien una distribució adaptada a la corba de la normalitat
se’ls va aplicar el Test de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis. Aquests anàlisis es realitzar
mitjançant el programa informàtic R 3.0.3 (R Core Team 2014).
5.3.3.3. Models de predicció: regressió logística per passos
L’anàlisi de regressió es focalitza en l’estudi de les relacions que hi ha entre una variable
depenent, i una o més variables independents (també anomenades variables predictores).
Aquest concepte s’expressa mitjançant la següent equació:
y = α + β1x1 + β2x2 + ... + βkxk + ε,
on “y” és la variable depenent i “x” és la independent, “α” és l’ordenada a l’origen, “β”
la pendent de la corresponent variable “x”, i “ε” és el residual. Quan la variable depenent
és dicotòmica s’utilitza la regressió logística (Martínez-González 2006).
En el moment de crear el model de predicció mitjançant una regressió, habitualment l’individu que està duent a terme l’anàlisi estadístic és qui decideix quines són les variables
independents més rellevants que cal introduir en el model en base als coneixements que
té sobre la qüestió que està intentant resoldre amb aquest mètode estadístic. No obstant,
també és possible utilitzar altres procediments estadístics per decidir quines variables són
les que permeten obtenir el millor model de predicció utilitzant el mínim nombre possible
de variables. Un d’aquests procediments és el mètode de selecció de variables per passos
(“stepwise”), el qual selecciona les variables que formaran part del model una a una
d’acord amb els seus valors de significació estadística i de correlació amb la variable
depenent. En primer lloc entra la “millor” variable independent, després entra la millor
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
137
de les restants, i així successivament fins que ja no quedin variables que compleixin els
criteris de selecció. Durant aquest procés es permet que una variable pugui formar part
del model si el seu valor de significació estadística és <0,05, mentre que si en algun dels
passos aquest valor per alguna de les variables del model és superior a aquest punt de tall,
aquesta és eliminada del model (Pardo i Ruiz 2001).
Aquests tipus d’anàlisis es van realitzar amb l’objectiu de dissenyar models de predicció
del consum dels aliments estudiats en cada cas utilitzant com a variables predictores els
biomarcadors seleccionats mitjançant els anàlisis multivariants. En aquest cas, el software
utilitzat va ser IBM SPSS Statistics, versió 20 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, Estats Units
d’Amèrica).
5.3.3.4. Corbes ROC
Les corbes de rendiment diagnòstic (ROC, de l’anglès Receiver Operating Characteristic) han estat àmpliament utilitzades en el camp de la biomedicina per a l’avaluació de la
capacitat dels biomarcadors per distingir entre els individus sans i malalts (per exemple,
els nivells de glucosa en sang per al diagnòstic de diabetis). En els estudis recollits en
aquest treball s’han utilitzat aquestes corbes per determinar la capacitat predictiva dels
models de predicció dissenyats mitjançant els anàlisis de regressió logística per passos.
La capacitat d’un biomarcador per distingir entre dues classes s’avalua mitjançant la seva
exactitud, la qual se sol avaluar a través dels paràmetres de sensibilitat i d’especificitat.
Considerant les aplicacions realitzades
Figura 5.8. Exemple de corbes ROC amb diferent capacitat predictiva.
en la present Tesi Doctoral, la sensibilitat és la proporció d’individus veritablement consumidors que el biomarcador
detecta com a consumidors, mentre que
l’especificitat és la proporció d’individus veritablement no consumidors que el
biomarcador detecta com a no consumidors. Existeix una sensibilitat i una especificitat concretes per a cada possible
punt de tall del biomarcador. D’aquesta
manera, i amb l’objectiu d’obtenir una
138
Metodologia
visió global de l’exactitud del biomarcador per a tots els punts de tall possibles, es construeix la corba ROC (Figura 5.8). En l’eix de les abscisses s’hi indica el valor resultant
del càlcul 1-especificitat (el que dóna una idea dels falsos positius), mentre que en l’eix
de les ordenades s’hi indica la sensibilitat (la proporció de positius reals). Així, la corba
ROC es construeix considerant diferents punts de tall que corresponen a les diferents parelles de valors 1-especificitat i sensibilitat.
Quan es vol comparar la capacitat predictiva de diferents biomarcadors se solen utilitzar
els seus valors d’àrea sota la corba (AUC, de l’anglès Area Under de Curve). Aquests
valors poden oscil·lar entre 0,5 i 1, on 1 representa un valor diagnòstic perfecte i 0,5
indica que el biomarcador té una capacitat diagnòstica equivalent a l’atzar. D’aquesta
manera, s’han establert els següents rangs de AUC per a la valoració de la capacitat predictiva dels biomarcadors: 0,9-1,0 = excel·lent; 0,8-0,9 = bo; 0,7-0,8 = regular; 0,6-0,7 =
dolent; i 0,5-0,6 = erroni (Xia et al. 2013).
El punt de tall òptim de les corbes ROC a partir del qual els individus seran assignats a
una classe o a l’altra es pot obtenir considerant la distància mínima de la corba respecte
l’angle superior esquerre. La distància de cadascun dels punts de la corba es pot calcular
mitjançant la següent equació:
d = arrel quadrada [(1 – Sn)2 + (1 – Sp)2],
on “Sn” fa referència a la sensibilitat i “Sp” a l’especificitat. D’aquesta manera, el punt
de la corba amb el valor “d” més petit serà el seleccionat per definir el punt de tall.
5.4. Identificació dels marcadors
Els metabòlits detectats per LC-MS es caracteritzen per un temps de retenció, una relació
massa-càrrega (m/z) i, en alguns casos, per un patró de fragmentació. La identificació
dels metabòlits es basa en procediments que utilitzen comparacions d’aquestes característiques amb els corresponents estàndards (si estan disponibles) inclosos tant en llibreries
d’espectrometria de masses públiques (disponibles a internet) com pròpies del grup de
recerca. Per a la determinació de l’estructura dels metabòlits també es poden incloure
experiments de MS/MS, els quals incrementen la informació del patró de fragmentació
dels metabòlits (Dunn et al. 2013).
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
139
5.4.1. Caracterització de metabòlits
Per a la identificació dels marcadors, en primer lloc cal esbrinar quins s’originen a partir
de la mateixa molècula. Per això, cal entendre la relació que hi ha entre ells, és a dir, quin
és l’ió molecular, quins són fragments, quins adductes i quins isòtops. En primer lloc cal
tenir en compte que els marcadors procedents de la mateixa molècula tindran el mateix
RT, ja que la fragmentació i producció dels ions té lloc després de la cromatografia. Per
tant, en un inici es podrien agrupar els marcadors senzillament per aquells que presenten
el mateix RT (Dunn et al. 2013). No obstant, hi ha molts compostos no relacionats entre
si que co-elueixen. Per separar aquells marcadors que co-elueixen, però que no estan relacionats entre si s’utilitza l’anàlisi de correlació entre ells. D’aquesta manera, per a la
caracterització dels metabòlits es va aplicar un protocol basat en l’anàlisi de clústers jeràrquics (HCA, de l’anglès Hierarchical Cluster Analysis) utilitzant el coeficient de Pearson (Tikunov et al. 2005).
5.4.1.1. Anàlisi de clústers jeràrquics (HCA)
La clusterització (o anàlisi de conglomerats) organitza les dades de tal manera que els
objectes (els marcadors en el nostre cas) que presenten elevades correlacions entre ells
s’agrupen en un mateix clúster. Per tant, es considera que aquelles agrupacions d’ions que
presenten el mateix RT formen part del mateix metabòlit (Dunn et al. 2013). El resultat
de la clusterització es presenta en un dendrograma com el que es mostra en la Figura 5.9.
Figura 5.9. Exemple d’anàlisi de clústers jeràrquics per a la clusterització dels ions
pertanyents a una mateixa molècula.
140
Metodologia
Per al HCA es va utilitzar el software PermutMatrix 1.9.3 (http://www.lirmm.fr/~caraux/PermutMatrix/), el qual permet realitzar anàlisis de clústers jeràrquics de dos factors,
és a dir, HCA aplicats simultàniament a les mostres i als marcadors. Les distàncies entre
les variables (mostres o marcadors) es van mesurar utilitzant la correlació de Pearson i el
mètode de Ward.
5.4.2. Anotació dels ions
En l’etapa d’anotació dels ions s’estableix si cada marcador es tracta de l’ió molecular,
un isòtop del mateix, un fragment o un adducte. Aquesta etapa es desenvolupa a partir
dels resultats obtinguts després de la clusterització descrita anteriorment. Una vegada els
marcadors han estat agrupats en clústers (en aquest cas també anomenats espectres), es
pot establir la relació existent entre ells. Aquestes anotacions es fan a partir de les diferències en els valors m/z que hi ha entre els marcadors que pertanyen a un mateix clúster.
Posteriorment, es procedeix a l’anotació de les diferències calculades considerant les diferències de m/z típiques en espectrometria de masses (http://fiehnlab.ucdavis.edu/staff/
kind/Metabolomics/MS-Adduct-Calculator) a partir d’una llista coneguda d’adductes
(com de Na+ o K+) i pèrdues neutrals (com de H2O, CO2 o NH3) (Levsen et al. 2007), així
com la pèrdua neutra dels conjugats de fase II o la diferència entre isòtops. Aquestes
anotacions s’assignen quan la diferència entre els valors m/z coincideix amb les diferències que formen part del llistat conegut (Dunn et al. 2013).
D’aquesta manera s’aconsegueix una important reducció del nombre de marcadors a considerar per a la identificació. A més, l’anotació també pot donar informació molt directa
sobre l’estructura del compost. Aquest és el cas de fragments molt específics com ara la
pèrdua de la fracció glucurònid o sulfat. Així, és possible utilitzar els clústers de marcadors com a espectres pseudo-MS/MS que podran ser utilitzats amb finalitats d’identificació.
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
141
5.4.3. Identificació de metabòlits
Finalment, es procedeix a la identificació principalment tenint en compte els valors m/z
dels marcadors que són considerats com l’ió molecular. No obstant, un mateix valor m/z
pot correspondre a diversos metabòlits diferents. Per això, durant aquest procés també
s’utilitza la informació procedent de la fragmentació en la font d’ionització, el RT, els
experiments de MS/MS, i/o la comparació amb patrons (en el cas que estiguessin disponibles) o amb eines computacionals “in silico” (Dunn et al. 2013).
5.4.3.1. Bases de dades
Per a la identificació dels metabòlits es van consultar les bases de dades Metaboloma
Humà (HMDB, de l’anglès Human Metabolome Database; http://www.hmdb.ca/), Phenol-Explorer
(http://www.phenol-explorer.eu/),
Metlin
(http://metlin.scripps.edu/),
MassBank (http://www.massbank.jp/), Lipidmaps (http://www.lipidmaps.org/) i Enciclopedia “Kyoto” de Gens i Genoma (KEGG, de l’anglès Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes; http://www.kegg.jp/).
HMDB proporciona la base de dades més completa del metaboloma humà (té més de
40.000 entrades de metabòlits), la qual conté informació detallada sobre metabòlits de
baix pes molecular: compostos endògens, exògens/xenobiòtics, derivats de la microbiota
o de biotransformacions en l’organisme (Wishart et al. 2007; Wishart et al. 2009; Wishart
et al. 2013).
Phenol-Explorer és una base de dades sobre el contingut de polifenols dels aliments, així
com dels respectius metabòlits detectats en diversos fluids biològics després del consum
d’aliments rics en polifenols (Neveu et al. 2010; Rothwell et al. 2012; Rothwell et al.
2013).
Les bases de dades Metlin (Smith et al. 2005; Tautenhahn et al. 2012; Zhu et al. 2013) i
MassBank (Horai et al. 2010) recullen informació de metabòlits, incloent les corresponents dades d’experiments MS/MS.
Lipidmaps conté una extensa base de dades (LMSD) sobre l’estructura i principals característiques dels lípids biològicament més rellevants (Sud et al. 2007).
Finalment, KEGG es tracta d’una base de dades que recull informació sobre nombroses
rutes metabòliques i compostos que interactuen amb aquestes vies (Kanehisa et al. 2012).
142
Metodologia
Addicionalment, la tasca d’identificació va ser millorada amb la creació d’una base de
dades pròpia obtinguda analíticament pel nostre grup d’investigació i altres metabòlits
que han estat recopilats de la bibliografia especialitzada, tant del metabolisme de fitoquímics com de metabòlits relacionats amb la patologia cardiovascular (incloent aquells relacionats amb l’obesitat, diabetis, tabaquisme, hipertensió, arteriosclerosis, etc.) i malalties relacionades amb l’edat (incloent la neurodegenerativa, osteoporosi, etc.). La búsqueda en aquestes bases de dades es va fer utilitzant un script de R (Fernandez-Albert et
al. 2014).
5.4.3.2. Temps de retenció
Una altra característica important dels compostos que es pot utilitzar durant el procés
d’identificació és el temps de retenció. No obstant, cal tenir en compte que el RT és específic del tipus de columna i del mètode cromatogràfic i, per tant, sol diferir entre els
resultats aportats entre diferents grups d’investigació que no segueixen una mateixa configuració cromatogràfica. En conseqüència, per conèixer el RT d’un determinat metabòlit
cal disposar del corresponent estàndard pur, de manera que el RT obtingut pugui ser comparat amb el del metabòlit que s’està intentant identificar sota les mateixes condicions
cromatogràfiques (Dunn et al. 2013).
5.4.3.3. Espectrometria de masses en tàndem (MS/MS)
Amb l’objectiu d’obtenir dades més concretes sobre l’estructura dels compostos d’interès
(determinats després de l’anàlisi estadístic, el qual s’aborda en la Secció 5.3.3) es duen a
terme els anomenats experiments d’espectrometria de masses en tàndem (MS/MS). La
tècnica d’ionització ESI genera ions moleculars, adductes i/o fragments simples. La fragmentació depèn de l’estructura del compost i implica ruptura d’enllaços de la molècula
per alliberar parts de la mateixa (Dunn et al. 2013), com pèrdues de la fracció glucurònid
o sulfat, d’aigua o de CO2, per exemple. Mitjançant els experiments MS/MS s’apliquen
uns voltatges més elevats a les molècules d’interès provocant una major fragmentació, el
que permet conèixer amb més precisió la seva estructura. Generalment aquest procés està
compost per dues fases (conegut com a experiment MS/MS o MS2), obtenint-se l’espectre
de fragmentació de l’ió escollit (anomenat com a ió precursor o ió pare). En determinats
casos es poden aplicar més nivells de fragmentació mitjançant el que es coneix com a
Capítol 05. Anàlisi metabolòmic no dirigit per HPLC-q-ToF-MS
143
MSn. En aquest cas, l’ió precursor es pot fragmentar mitjançant un experiment de MS 2,
al qual el segueix la fragmentació d’un o més dels seus fragments (tradicionalment coneguts com a ions fills) en un experiment de MS3, el qual a la vegada també pot ser seguit
per la fragmentació d’un o més dels ions néts en un experiment MS4, i així successivament
(Dunn et al. 2013).
Els experiments MS/MS funcionen mitjançant l’ús del quadrupol per filtrar tots els ions
amb l’excepció del d’interès gràcies al mode “selected ion monitoring”. Llavors, els ions
seleccionats passen per la cel·la de col·lisió on se’ls hi apliquen diferents voltatges per
incrementar l’energia i així provocar una major fragmentació. La massa del fragment
dóna informació sobre l’estructura de part de la molècula, i la combinació de tots els
fragments i pèrdues neutres pot, per tant, ser utilitzada per deduir l’estructura dels compostos (Dettmer et al. 2007).
5.4.3.4. Fragmentació “in silico”
Amb l’objectiu d’obtenir més informació sobre l’estructura dels metabòlits es poden utilitzar eines que permetin predir el perfil de fragmentació dels compostos a partir d’una
estructura molecular coneguda. D’aquesta manera es poden comparar els fragments observats experimentalment amb els fragments calculats “in silico” (enlloc d’utilitzar l’espectre de masses obtingut a partir d’estàndards purs) (Dunn et al. 2013). MetFrag
(http://msbi.ipb-halle.de/MetFrag/) és una eina disponible online que permet fragmentar
virtualment (“in silico”) les molècules recuperant les respectives estructures a partir de
les biblioteques de compostos com Chemspider, KEGG o PubChem, o bé facilitant-li
l’estructura a través de fitxers SDF (Wolf et al. 2010). A continuació, les estructures són
virtualment fragmentades, el que significa que MetFrag trenca la molècula en totes les
posicions possibles i calcula el valor m/z dels fragments resultants. Cal tenir en compte
que MetFrag no pot considerar els adductes o re-ordenaments i, per tant, un valor observat
experimentalment podria no ser explicat per MetFrag.
144
Metodologia
5.4.3.5. Nivells d’identificació
La Iniciativa d’Estàndards Metabolòmics ha definit quatre nivells d’identificació dels
compostos tenint en compte les dades obtingudes per cadascun (Sumner et al. 2007). A
tots aquells compostos identificats comparant el patró de fragmentació i el RT amb el
corresponent estàndard pur mitjançant l’ús de les mateixes condicions analítiques se’ls
assigna el nivell I. Es consideren identificacions de nivell II aquelles en les que el patró
de fragmentació del compost coincideix amb els fragments indicats en les bases de dades
o en la bibliografia científica. El nivell III s’utilitza per a la identificació dels compostos
basada en les característiques de la classe a la que pertany el compost, mentre que s’assigna el nivell IV per als compostos que no s’han aconseguit identificar.
5.5. Interpretació biològica
Una vegada realitzades les identificacions cal establir una interpretació biològica rellevant en relació amb la pregunta de la investigació. Per dur a terme aquest procés es poden
utilitzar diverses eines. Una d’elles és la base de dades KEGG, la qual permet posicionar
els metabòlits en les seves corresponents rutes metabòliques i, d’aquesta manera, estudiar
possibles relacions metabòliques entre ells (Kanehisa et al. 2012). A més, els metabòlits
inclosos en la base de dades HMDB es descriuen breument en un “MetaboCard”, el qual
conté les característiques químiques, clíniques i bioquímiques del corresponent compost
(Wishart et al. 2013). A la vegada, també s’ha de buscar intensament en la bibliografia
científica amb l’objectiu de situar el metabòlit identificat en un context biològic adequat.
Resultats
Capítol 06.
Identificació de Biomarcadors d’Ingesta de Pa en
una Població en Condicions de Vida Lliure
Els resultats de l’anàlisi de les diferències en el metaboloma urinari segons la ingesta
habitual de pa, ja sigui blanc o integral, s’han publicat a la revista Metabolomics indexada
en el Journal Citation Reports amb un factor d’impacte de 4,433 (2012) i situada en el
primer quartil de la categoria Endocrinology & Metabolism (29/122):
Mar Garcia-Aloy, Rafael Llorach, Mireia Urpi-Sarda, Sara Tulipani, Jordi SalasSalvadó, Miguel Angel Martínez-González, Dolores Corella, Montserrat Fitó, Ramon Estruch, Lluis Serra-Majem, Cristina Andres-Lacueva. Nutrimetabolomics
fingerprinting to identify biomarkers of bread exposure in a free-living population
from the PREDIMED study cohort. Metabolomics. 2014 [en premsa]. doi: 10.1007/
s11306-014-0682-6.
Resum:
El pa és un dels aliments més consumits en la majoria de patrons dietètics. Això ha provocat que el seu impacte en la salut humana sigui d’especial interès per als investigadors.
L’objectiu d’aquest treball va ser identificar biomarcadors de consum de pa mitjançant
l’aplicació d’una aproximació nutrimetabolòmica en una població en condicions de vida
lliure.
Mitjançant una aproximació HPLC-q-ToF-MS no dirigida juntament amb anàlisis multivariants (OSC-PLS-DA) es va analitzar l’orina de 155 individus estratificats en tres grups
segons el seu consum habitual de pa: no consumidors de pa (n = 56), consumidors de pa
blanc (n = 48), i consumidors de pa integral (n = 51) (Figura 6.1).
148
Resultats
Els metabòlits més diferencials (VIP ≥ 1,5) van incloure compostos procedents de fitoquímics de les plantes, com metabòlits dels benzoxazinoides i dels alquilresorcinols i
compostos produïts per la microbiota (metabòlits de les enterolactones, àcid hidroxibenzoic i àcid dihidroferúlic). També es va identificar temptativament la pirralina, l’àcid 3indolcarboxílic glucurònid, la riboflavina, la 2,8-dihidroxiquinolina glucurònid i la N-αacetilcitrulina.
Per tal de combinar diversos metabòlits en un model de predicció del consum de pa es va
utilitzar un anàlisi de regressió logística per passos. Es van construir corbes ROC per
avaluar la capacitat predictiva tan dels metabòlits individuals com de la seva combinació.
Els valors de l’àrea sota la corba [AUC (95% CI)] dels models combinats van oscil·lar
entre el 77,8% (69,1% - 86,4%) i el 93,7% (89,4% - 98,1%), mentre que les AUC per als
metabòlits inclosos en els models de predicció tenien valors més febles quan s’avaluaven
individualment: les AUC van oscil·lar des del 58,1% (46,6%-69,7%) al 78,4% (69,8% 87,1%).
Els resultats d’aquest estudi van demostrar que una ingesta diària de pa té un impacte
significatiu en el metaboloma urinari, tot i ser avaluat en condicions de vida lliure. També
es va demostrar que la capacitat predictiva d’una combinació de diversos biomarcadors
d’exposició dietètica és millor que la d’un sol biomarcador.
Figura 6.1. Gràfic resum de l’anàlisi de les diferències en el metaboloma urinari segons el
consum habitual de pa.
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
149
150
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
151
152
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
153
154
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
155
156
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
157
158
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
159
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
161
162
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
163
164
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
165
166
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
167
168
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
169
170
Resultats
Capítol 06. Identificació de biomarcadors d’ingesta de pa
171
172
Resultats
Capítol 07.
Estudi Metabolòmic de l’Efecte de la Fruita Seca
en Individus amb Síndrome Metabòlica
En col·laboració amb la Unitat de Nutrició Humana de la Facultat de Medicina i Ciències
de la Salut de la Universitat Rovira i Virgili (Dr. Jordi Salas-Salvadó i Dra. Mònica Bulló)
i mitjançant el finançament a través del projecte CONSOLIDER FUN-C-FOOD
(CSD2007-063), s’ha analitzat l’efecte en el metaboloma urinari d’un consum de 30
grams de fruita seca durant 12 setmanes en individus amb síndrome metabòlica.
Aquest treball s’ha publicat a la revista Journal of Proteome Research indexada en el
Journal Citation Reports amb un factor d’impacte de 5,056 (2012) i situada en el primer
quartil de la categoria Biochemical Research Methods (10/75):
Sara Tulipani, Rafael Llorach, Olga Jáuregui, Patricia López-Uriarte, Mar GarciaAloy, Mònica Bulló, Jordi Salas-Salvadó, Cristina Andrés-Lacueva. Metabolomics
unveils urinary changes in subjects with metabolic syndrome following 12-week
nut consumption. Journal of Proteome Research. 2011;10(11):5047-5058. doi: 10.
1021/pr200514h.
Resum:
En aquesta publicació es van determinar els canvis en el metaboloma urinari d’individus
amb síndrome metabòlica sotmesos a una intervenció nutricional de 12 setmanes amb un
consum de 30 grams diaris de fruita seca en comparació a una dieta control a través d’una
aproximació metabolòmica no dirigida per HPLC-q-ToF-MS, i seguida d’anàlisis multivariants (Figura 7.1). Aquesta estratègia va permetre discriminar 20 marcadors associats
a l’efecte de la intervenció nutricional amb fruita seca. Posteriorment, i amb la finalitat
de confirmar els compostos inicialment identificats de forma temptativa, els metabòlits
174
Resultats
discriminants es van sotmetre a experiments d’espectrometria de masses en tàndem utilitzant LC-ITD-FT-MS. L’aproximació metabolòmica va revelar que els marcadors d’ingesta de fruita seca inclouen metabòlits conjugats dels àcids grassos, metabòlits fenòlics
de fase II i derivats de la microbiota, i metabòlits de la serotonina. D’aquesta manera, per
primera vegada es va associar una excreció incrementada de metabòlits de la serotonina
amb el consum de fruita seca. A més a més, la detecció de marcadors urinaris del metabolisme microbià i de fase II dels polifenols de la fruita seca va confirmar la seva biodisponibilitat, pel que els potencials mecanismes de bioactivitat són una interessant àrea de
recerca per a la determinació dels efectes en la salut derivats del consum de fruita seca.
Els resultats obtinguts van confirmar com una estratègia metabòlomica no dirigida pot
ajudar a accedir a les rutes metabòliques no explorades fins al moment que estan afectades
per la dieta, augmentant així les perspectives per a la implementació de noves dianes
d’intervenció.
Figura 7.1. Gràfic resum de l’efecte del consum de fruita seca en el metaboloma urinari
d’individus amb síndrome metabòlica.
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
175
176
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
177
178
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
179
180
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
181
182
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
183
184
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
185
186
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
187
188
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
189
190
Resultats
Capítol 07. Estudi metabolòmic de l’efecte de la fruita seca
191
Capítol 08.
Biomarcadors Nutricionals del Consum de Nous:
Noves Estratègies per al Disseny de Patrons de
Biomarcadors
Els resultats de l’estudi sobre l’empremta metabòlica de les nous per a la construcció d’un
patró de biomarcadors del consum d’aquest aliment s’han publicat a la revista Journal of
Proteome Resarch indexada en el Journal Citation Reports amb un factor d’impacte de
5,056 (2012) i situada en el primer quartil de la categoria Biochemical Research Methods
(10/75):
Mar Garcia-Aloy, Rafael Llorach, Mireia Urpi-Sarda, Sara Tulipani, Ramon Estruch, Miguel A. Martínez-González, Dolores Corella, Montserrat Fitó, Emilio Ros,
Jordi Salas-Salvadó, Cristina Andres-Lacueva. Novel multi-metabolite prediction
of walnut consumption by a urinary biomarker model in a free-living population:
the PREDIMED study. Journal of Proteome Research. 2014;13(7):3476-3483. doi:
10.1021/pr500425r.
Resum:
L’efecte beneficiós de les nous en la salut s’ha atribuït a la seva particular composició
química. En l’estudi dels mecanismes subjacents entre la dieta i la salut, la nutrimetabolòmica ha esdevingut una eina prometedora, la qual també està sent molt utilitzada per al
descobriment de nous biomarcadors d’exposició dietètica.
L’objectiu d’aquest estudi va ser caracteritzar l’empremta metabòlica del consum de nous
en orina d’individus en condicions de vida lliure i utilitzant una aproximació metabolòmica no dirigida. Per aquest motiu es van utilitzar mostres biològiques recollides a l’inici
194
Resultats
de l’estudi PREDIMED (moment basal). Es van incloure un total de 381 individus dividits
en dos grups de 195 (grup d’entrenament) i 186 (grup de validació) individus. Per a la
selecció dels individus es va tenir en compte el seu consum de nous (dicotomitzat en no
consumidors versus consumidors habituals). Les mostres d’orina es van analitzar per cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses. Els metabòlits més discriminants
del consum de nous van ser seleccionats mitjançant anàlisis multivariants (VIP ≥ 1,5).
Posteriorment, es va utilitzar un anàlisi de regressió logística per passos per seleccionar
un model de predicció multi-metabòlit d’exposició a nous. La capacitat predictora del
model i de cada metabòlit inclòs es va avaluar mitjançant corbes ROC i utilitzant els
valors de l’àrea sota la corba (AUC) (Figura 8.1).
L’exposició dietètica a les nous principalment es va caracteritzar per 18 metabòlits, incloent marcadors del metabolisme dels àcids grassos, compostos microbians derivats dels
el·lagitanins, i metabòlits intermedis de la ruta metabòlica del triptòfan i la serotonina. El
model predictiu d’exposició a les nous va incloure almenys un component de cada classe.
La AUC (95% CI) per al model del biomarcador combinat va ser de 93,5% (90,1% 96,8%) en el conjunt d’entrenament i 90,2% (85,9% - 94,6%) en el conjunt de validació.
En canvi, els valors de les AUC per als metabòlits individuals van ser ≤85%.
Figura 8.1. Gràfic resum de l’estudi sobre l’empremta metabòlica del consum de nous en
una població de risc cardiovascular en condicions de vida lliure.
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
195
Els resultats d’aquest estudi mostren que l’empremta metabòlica urinària corresponent a
l’exposició dietètica a les nous es caracteritza per una combinació de metabòlits de diferents classes. Quan es fusionen en un model de predicció multi-metabòlit s’obté una millor capacitat de predicció que la de qualsevol metabòlit individualment. Fins on sabem,
aquest és el primer estudi que proposa una combinació de biomarcadors d’exposició dietètica a les nous en una població en condicions de vida lliure, com sol considerar-se en
els estudis epidemiològics que examinen les associacions entre la dieta i la salut.
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
197
198
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
199
200
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
201
202
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
203
204
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
205
206
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
207
208
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
209
210
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
211
212
Resultats
Capítol 08. Biomarcadors nutricionals de consum de nous
213
214
Resultats
Capítol 09.
Estudi Metabolòmic de l’Efecte del Cacau en Pols
en Individus amb Elevat Risc Cardiovascular
En el marc del projecte AGL2004-08378-C02-01 “Biodisponibilitat en humans dels metabòlits dels polifenols presents en els solubles de cacau: efecte de la microbiota intestinal
després de la ingesta aguda i crònica de cacau”, coordinat en col·laboració entre la Universitat de Barcelona i la Fundació Clínic, s’ha analitzat l’impacte del consum regular de
solubles de cacau en el metaboloma urinari d’individus amb un elevat risc cardiovascular.
Aquest treball s’ha publicat a la revista Molecular Nutrition & Food Research indexada
en el Journal Citation Reports amb un factor d’impacte de 4,310 (2012) i situada en el
primer decil de la categoria Food Science & Technology (4/124):
Rafael Llorach, Mireia Urpi-Sarda, Sara Tulipani, Mar Garcia-Aloy, Maria Monagas, Cristina Andrés-Lacueva. Metabolomic fingerprint in patients at high risk of
cardiovascular disease by cocoa intervention. Molecular Nutrition and Food Research. 2013;57(6):962-973. doi: 10.1002/mnfr.201200736.
Resum:
Considerant que les aproximacions metabolòmiques se centren en la identificació de tots
els metabòlits presents en una mostra biològica (metaboloma), i que el consum de productes derivats del cacau s’ha relacionat amb beneficis per a la salut, incloent l’efecte
positiu en la salut cardiovascular, l’objectiu del present treball va ser aplicar una estratègia
metabolòmica en un assaig clínic aleatoritzat, creuat i controlat per avaluar els efectes en
el metaboloma urinari del consum de cacau a llarg termini, considerant tant els biomarcadors d’ingesta com els d’efecte.
216
Resultats
Després d'un període de rentat de 2 setmanes, els vint individus inclosos en l’estudi van
rebre 40 g/dia de cacau en pols juntament amb 500 mL de llet desnatada (grup d’intervenció de cacau dissolt en llet desnatada) o 500 mL/dia de llet desnatada (grup d’intervenció amb llet desnatada) durant un període de 4 setmanes. A l’inici de l’estudi (període
basal) i després de cada intervenció es van obtenir mostres d’orina de 24 hores, les quals
van ser analitzades per HPLC-q-ToF-MS utilitzant els modes d'ionització positiu i negatiu, i prosseguint amb un anàlisi multivariant (Figura 9.1).
Aquest anàlisi va revelar una marcada separació entre el període basal, la intervenció amb
llet desnatada i la intervenció amb cacau dissolt en llet desnatada. Aquestes diferències
es van associar amb 39 compostos relacionats amb el consum de cacau, inclosos metabòlits d'alcaloides, metabòlits de polifenols (hidroxifenilvalerolactones i àcids hidroxifenilvalèrics), dicetopiperacines i aminoàcids N-fenilpropenoil.
En el cas dels metabòlits endògens, les identificacions van suggerir una reducció associada al consum de cacau en metabòlits relacionats amb el metabolisme de la carnitina i
amb la sulfatació de tirosina. Aquests metabòlits podrien estar relacionats amb la malaltia
cardiovascular, tot i que són necessaris estudis específics per a avaluar si els canvis en
aquests marcadors són conseqüència d’alguna alteració metabòlica associada a la ingesta
de cacau, o bé són causats per una regulació disminuïda o augmentada d’algunes vies
metabòliques que els afecten.
Figura 9.1. Gràfic resum de l’efecte del consum de cacau en pols en el metaboloma urinari
d’individus amb risc cardiovascular.
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
217
Els resultats d’aquesta publicació van permetre demostrar que l’estratègia metabolòmica
no dirigida per HPLC-q-ToF-MS permet la definició d'un perfil metabòlic associat a la
ingesta de cacau en pols. De la mateixa manera, la identificació de marcadors endògens
podria donar lloc a noves hipòtesis per desxifrar la relació existent entre el consum de
cacau i les malalties cardiovasculars.
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
219
220
Resultats
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
221
222
Resultats
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
223
224
Resultats
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
225
226
Resultats
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
227
228
Resultats
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
229
230
Resultats
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
231
232
Resultats
Capítol 09. Estudi metabolòmic de l’efecte del cacau en pols
233
Capítol 10.
Anàlisi de l’Empremta Metabòlica del Consum Habitual de Productes Derivats del Cacau en Individus en Condicions de Vida Lliure
En el marc de l’estudi PREDIMED s’ha analitzat el perfil del metaboloma urinari associat
al consum habitual de productes derivats del cacau en individus en condicions de vida
lliure. Aquest treball s’ha enviat en una revista indexada en el Journal Citation Reports
per a la seva publicació i actualment es troba en procés de revisió:
Mar Garcia-Aloy, Rafael Llorach, Mireia Urpi-Sarda, Olga Jáuregui, Jordi SalasSalvadó, Miguel A. Martínez-González, Dolores Corella, Montserrat Fitó, Ramon
Estruch, Cristina Andrés-Lacueva. Untargeted metabolomics approach to obtain a
metabolic footprint of regular dietary consumption by designing models of combined urinary biomarkers: Cocoa product intake in free-living subjects from the
PREDIMED study. [En procés de publicació].
Resum:
L'avaluació precisa de l'exposició a la dieta és un dels principals reptes de l’actual investigació nutricional. Recentment, s’ha proposat l'estudi de metaboloma alimentari com una
potent estratègia per detectar i validar nous biomarcadors d’ingesta que es podrien aplicar
en estudis realitzats amb individus en condicions de vida lliure.
L'objectiu d'aquest estudi va ser aplicar una estratègia metabolòmica no dirigida per caracteritzar un potencial model de biomarcadors d'ingesta de productes del cacau en una
població en condicions de vida lliure sense cap tipus d’estandardització de la dieta.
Per a la consecució de l’objectiu plantejat es va aplicar una estratègia metabolòmica no
dirigida per HPLC-q-ToF-MS en l'orina de 32 consumidors de productes derivats del cacau (CC) i 32 individus control no consumidors de cacau (NC). Es van seleccionar com
236
Resultats
a biomarcadors discriminants aquells metabòlits que en l’anàlisi multivariant OSC-PLSDA van obtenir uns valors VIP ≥1,5 (Figura 10.1).
Els anàlisis multivariants van mostrar clares diferències entre els grups NC i CC. La majoria dels metabòlits identificats com a discriminants del grup CC respecte al NC estaven
relacionats amb el metabolisme de la teobromina i dels polifenols, així com compostos
produïts durant els processos d'elaboració del cacau. El consum de productes de cacau
també es va associar amb unes menors excrecions urinàries de metilglutarilcarnitina, les
quals podrien estar relacionades amb els efectes de l'exposició del cacau sobre la resistència a la insulina.
Posteriorment, i per tal de millorar la predicció del consum de cacau, es va construir un
model que combinava diversos metabòlits utilitzant aquells que pertanyien al metaboloma
alimentari. Els valors de la AUC (IC 95%) pel model van ser de 95,7% (89,8%-100%) i
del 92,6% (81,9%-100%) en els conjunts d'entrenament i de validació, respectivament,
mentre que les AUC dels metabòlits individuals van ser <90%.
Aquest estudi mostra l’empremta metabòlica associada al consum habitual de productes
derivats del cacau en individus en condicions de vida lliure i revela que la combinació de
diferents metabòlits en models de biomarcadors pot millorar la mesura de la ingesta dietètica.
Figura 10.1. Gràfic resum de l’anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de
productes derivats del cacau en individus en condicions de vida lliure.
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
237
238
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
239
240
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
241
242
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
243
244
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
245
246
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
247
248
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
249
250
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
251
252
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
253
254
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
255
256
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
257
258
Resultats
Capítol 10. Anàlisi de l’empremta metabòlica del consum habitual de cacau
259
260
Resultats
Discussió i Conclusions
Capítol 11.
Discussió General
La metabolòmica és la disciplina dedicada a l’estudi dels metabòlits, la seva dinàmica,
composició, interaccions i respostes a determinades intervencions o canvis en l’ambient
(Fiehn 2002). En matèria de nutrició, la metabolòmica s’ha proposat com una potent eina
capaç d’identificar nous biomarcadors d’ingesta alimentària, els quals poden millorar i
complementar els mètodes tradicionals, alhora que proporcionen una visió dels mecanismes subjacents a les relacions prèviament observades entre la dieta i la salut (Llorach et
al. 2012). Els estudis nutrimetabolòmics no dirigits han proporcionat una àmplia varietat
de nous biomarcadors d'exposició dietètica, el que, a la vegada, condueix al descobriment
de compostos bioactius amb potencials aplicacions per al disseny de nous aliments funcionals o suplements dietètics (Scalbert et al. 2014).
11.1. Biomarcadors d’exposició dietètica en estudis nutricionals
amb dissenys diferenciats
L'interès en l'ús de la metabolòmica per al descobriment de nous biomarcadors per a la
seva aplicació en l'epidemiologia nutricional ha augmentat notablement. No obstant, pràcticament no existeixen estudis que tinguin com objectiu la replicació d’aquests marcadors
en poblacions que viuen en condicions de vida lliure (Llorach et al. 2012). En aquest
context, aquesta replicació dels marcadors permet que el nivell d'evidència de les associacions observades s’incrementi, com s'ha suggerit prèviament per als estudis genòmics
(Chanock et al. 2007).
D’aquesta manera, les publicacions incloses en aquesta Tesi Doctoral han evidenciat la
replicació dels metabòlits discriminants de les empremtes metabòliques associades al
264
Discussió i Conclusions
consum de determinats aliments. Inicialment els marcadors de consum de fruita seca i
cacau van ser caracteritzats en estudis d’intervenció nutricional controlats (Tulipani et al.
2011; Llorach et al. 2013), la majoria dels quals també van ser els més diferencials en
una població analitzada de forma observacional i considerant la seva alimentació habitual
i en condicions de vida lliure (Garcia-Aloy et al. 2014b; Garcia-Aloy et al. 2014c).
El control de la dieta és un factor molt important i que pot tenir una elevada influència en
els resultats observats mitjançant l’aplicació d’una estratègia metabolòmica no dirigida,
ja que els aliments als que els individus estan exposats durant un estudi depenen de les
restriccions o intervencions dietètiques aplicades en el cas dels assajos clínics, o bé dels
hàbits alimentaris dels individus en el cas dels estudis de cohorts (Scalbert et al. 2014).
Aquest aspecte té una important repercussió en l’especificitat i sensibilitat dels marcadors
proposats. Per una banda, els marcadors identificats en estudis d’intervenció controlats
poden no tenir una especificitat suficient quan s’intenten aplicar en els estudis poblacionals, degut a que les dietes habituals poden incloure altres aliments que també continguin
els mateixos marcadors i que han estat restringits durant la intervenció nutricional. D’altra
banda, en els estudis observacionals cal tenir en compte que molts dels aliments se solen
ingerir de forma conjunta seguint determinats patrons de consum, el que pot comportar
una identificació de marcadors esbiaixada afectant a la seva sensibilitat (Scalbert et al.
2014). Així doncs, la replicació d’un marcador en estudis amb dissenys diferenciats (en
aquest cas, estudis controlats d’intervenció i estudis observacionals) és una indicació de
que es tracta d’un metabòlit amb elevada especificitat i sensibilitat (Andersen 2013).
D’aquesta manera, la replicació dels biomarcadors en l’estudi observacional detectats
prèviament en els assajos clínics demostra la consistència en els resultats dels anàlisis de
les empremtes metabòliques malgrat la seva aplicació en estudis amb dissenys diferenciats.
Un altre aspecte a considerar en l’estudi dels biomarcadors és el tipus de mostra biològica
utilitzada. L’orina, juntament amb el plasma i el sèrum, és un dels fluids biològics més
utilitzats en els estudis de metabolòmica. En aquest sentit, l’orina ha mostrat reflectir una
major concentració de metabòlits derivats dels aliments que el plasma (Scalbert et al.
2014). Tots els treballs inclosos en aquesta Tesi Doctoral s’han realitzat amb mostres
d’orina i, per tant, els marcadors urinaris són el tema central. Les mostres d’orina de 24
hores han estat descrites com un mètode més robust per monitoritzar la ingesta dietètica
diària en comparació amb l’anàlisi d’una orina puntual (Spencer et al. 2008; Zamora-Ros
Discussió general
265
et al. 2011). Aquest és el tipus de mostra biològica utilitzada en els estudis referents als
assajos clínics amb intervencions dietètiques inclosos en aquest treball (Tulipani et al.
2011; Llorach et al. 2013). No obstant, la recollida de mostres d’orina de 24 hores és una
tasca de difícil compliment estricte i poc pràctica, especialment en els estudis epidemiològics a gran escala (Potischman 2003; Zamora-Ros et al. 2011). Per tant, la replicació
dels marcadors d’exposició, inicialment caracteritzats en mostres d’orina de 24 hores, en
les mostres d’orina puntuals reforça el seu poder discriminatori independentment del tipus
de mostra utilitzada (Garcia-Aloy et al. 2014b; Garcia-Aloy et al. 2014c).
Finalment, el curs del temps d’excreció de tot compost candidat a biomarcador d’exposició dietètica definirà si el compost es tracta d’un marcador d’ingesta a curt, mig o llarg
termini. Per exemple, en el cas de l’estudi del metaboloma urinari associat al consum
habitual del cacau (Garcia-Aloy et al. 2014c) es va poder observar com els metabòlits que
es van mantenir discriminants, independentment del disseny de l’estudi, eren aquells que
presenten uns patrons d’excreció d’almenys 24 hores després d’ingerir l’aliment, com és
el cas de la teobromina i dels metabòlits dels polifenols derivats del metabolisme microbià
(Rodopoulos et al. 1996; Llorach et al. 2009). Per tant, aquestes observacions reforcen la
idea que en els individus inclosos en estudis observacionals que es mantenen en condicions de vida lliure, els biomarcadors que s’excreten més tardanament podrien ser millors
predictors de la ingesta d’aliments que no pas els que s’excreten més ràpidament (PujosGuillot et al. 2013; Andersen et al. 2014a). Per contra, els biomarcadors associats a la
ingesta a curt termini únicament seran útils en aquelles poblacions que consumeixen les
corresponents fonts dietètiques amb certa regularitat i freqüència (Lloyd et al. 2013).
11.2. Disseny de models de biomarcadors per a la millora de la
predicció de l’exposició dietètica
Tenint en compte que la majoria dels components dels aliments es troben àmpliament
distribuïts en diversos aliments, són molt pocs els compostos que poden ser considerats
com a biomarcadors d’un determinat aliment o grup d’aliments. Aquest seria el cas de la
prolina betaïna per a la ingesta de cítrics (Heinzmann et al. 2010; Lloyd et al. 2011) i el
resveratrol per al consum de vi (Zamora-Ros et al. 2009). Addicionalment, també cal tenir
266
Discussió i Conclusions
en compte que en algunes ocasions compostos diferenciats, després de patir diversos processos metabòlics en l’organisme, poden convergir en metabòlits comuns, com és el cas
de diversos grups de polifenols del vi que després de la seva ingesta i metabolisme solen
transformar-se en àcids fenòlics comuns (Boto-Ordonez et al. 2014), o bé el de les diferents classes d’el·lagitanins que es troben en nous, magranes o maduixes i que tots ells
convergeixen en la formació de les urolitines (Espin et al. 2013; Garcia-Munoz i Vaillant
2014).
Per resoldre aquesta qüestió, en la present Tesi Doctoral s’ha proposat que combinant
més d’un compost característic de metaboloma alimentari (o “food metabolome”) associat a la ingesta de determinats aliments es podria aconseguir una mesura més precisa del
seu consum. En aquest sentit, es va demostrar que generant models de biomarcadors d’exposició formats per més d’un metabòlit s’obtenen millors resultats que amb les mesures
obtingudes per a cada marcador individualment (Garcia-Aloy et al. 2014a; Garcia-Aloy
et al. 2014b; Garcia-Aloy et al. 2014c). Aquests resultats reforcen la hipòtesi que s’aconsegueix una millor capacitat per discriminar l’exposició dietètica mitjançant l’ús de models de biomarcadors confeccionats per més d’un metabòlit. És important recalcar que en
aquests models van formar part metabòlits de diferent naturalesa, molt probablement degut a que cadascun d’aquests metabòlits dóna informació complementària sobre la ingesta
dietètica, mentre que els que han quedat fora del model probablement no contribueixen
amb cap informació biològica o de la dieta més rellevant a la que proporcionen els que ja
han format part del corresponent model.
Fins a l’actualitat són molt pocs els casos que es poden trobar en la bibliografia científica
que hagin intentat treballar amb combinacions de biomarcadors nutricionals per a la millora de la capacitat predictiva de les mesures d’exposició dietètica (Scalbert et al. 2014).
Un dels pocs exemples que s’han proposat fins al moment és el càlcul de la ràtio entre 2
alquilresorcinols per al consum de cereals integrals (Chen et al. 2004). No obstant, en
aquesta Tesi Doctoral es realitza una nova proposta que permet la consideració de ≥2
compostos diferenciats. Aquest fet representa una important novetat en el camp de la nutrimetabolòmica obrint una via alternativa al descobriment de nous biomarcadors d’exposició dietètica o de compliment en futurs estudis d’intervenció nutricional a llarg termini realitzats amb individus en condicions de vida lliure.
Discussió general
267
11.3. Caracterització de les empremtes metabòliques per a la determinació de biomarcadors d’ingesta: importància del “food
metabolome”
Els marcadors d’exposició idealment són una expressió dels canvis en el metaboloma
alimentari (“food metabolome”), que correspon a tots aquells metabòlits derivats directament de la ingesta d’aliments, la seva absorció i biotransformació tissular i per part de la
microbiota (Fardet et al. 2008). La identificació d’aquests metabòlits pot informar sobre
els aliments als que l’organisme ha estat exposat i com aquests han estat metabolitzats
abans de ser excretats.
La present Tesi Doctoral ha identificat els marcadors relacionats amb 3 aliments de consum habitual en el patró alimentari de les poblacions estudiades. En aquest sentit, en la
publicació 1 (Garcia-Aloy et al. 2014a) es presenten els resultats de l’anàlisi del metaboloma urinari associat a una ingesta diària de pa, tant blanc com integral. Pel que fa als
marcadors pertanyents al metaboloma alimentari, és important destacar que la majoria
d’ells estaven relacionats amb compostos derivats dels fitoquímics dels cereals, com els
benzoxazinoids i alquilresorcinols, entre d’altres compostos característics de la composició i processament del pa.
Les publicacions 2 i 3 (Tulipani et al. 2011; Garcia-Aloy et al. 2014b) indiquen que l’empremta metabòlica urinària associada a la ingesta de fruita seca, i més concretament de
les nous, es caracteritza per un panell de biomarcadors de diferents classes, incloent marcadors del metabolisme dels àcids grassos insaturats (probablement atribuïble al gran augment de la ingesta d’àcids grassos poliinsaturats a través del consum de fruita seca), compostos microbians derivats dels polifenols característics d’aquests aliments (en particular
de les urolitines procedents del metabolisme dels el·lagitanins de les nous), i metabòlits
intermedis de la ruta dels metoxindols, la qual condueix a la biosíntesi de serotonina i
melatonina a partir del triptòfan.
Finalment, pel que fa als marcadors del consum de cacau, les publicacions 4 i 5 (Llorach
et al. 2013; Garcia-Aloy et al. 2014c) mostren que els principals compostos directament
relacionats amb la ingesta de cacau inclouen metabòlits derivats del metabolisme dels
compostos propis del cacau, com els alcaloides i els polifenols, així com altres compostos
derivats dels procediments de fabricació de productes alimentaris amb cacau, com el torrat o la fermentació.
268
Discussió i Conclusions
11.4. Descobriment de marcadors d’efecte associats a la ingesta
de determinats aliments
Les empremtes metabòliques associades al consum de determinats aliments també poden
presentar com a metabòlits diferencials compostos endògens que evidentment no provenen de l’aliment, però que els seus nivells també estan associats amb la seva ingesta.
D’aquesta manera, és possible hipotetitzar sobre els potencials mecanismes i efectes en
la salut de l’exposició a un determinat aliment mitjançant l’estudi dels canvis en el metabolisme endogen. La identificació de metabòlits específics pot proporcionar informació
sobre les rutes metabòliques que es veuen afectades pel consum habitual de diferents aliments. D’aquesta manera es poden generar nous coneixements sobre els mecanismes
d’acció per als potencials efectes sobre la salut dels diferents aliments en estudi (Llorach
et al. 2012).
En referència als marcadors endògens associats a la ingesta de pa, en la publicació 1
(Garcia-Aloy et al. 2014a) es va observar una major excreció urinària de 2,8-dihidroxiquinolina-β-D-glucurònid entre els consumidors de pa integral, el que suggereix una nova
hipòtesi sobre un possible mecanisme biològic implicat en els efectes beneficiosos observats amb la ingesta de pa integral a través dels receptors PPARα, ja que la 2,8-dihidroxiquinolina-β-D-glucurònid s’ha proposat com un biomarcador per a aquest tipus de receptors (Zhen et al. 2007). A la vegada, també es van observar majors nivells de N-α-acetilcitrulina entre els no consumidors de pa. Aquest és un metabòlit que podria estar relacionat amb una disminució en la síntesi d’arginina, els nivells de la qual s’han associat inversament amb diversos paràmetres relacionats amb la malaltia cardiovascular (Tousoulis
et al. 2002).
Un altre exemple d’aquest tipus de marcadors són els dos metabòlits de la ruta metabòlica
del triptòfan i de la serotonina associats a la ingesta de fruita seca en les publicacions 2 i
3 (Tulipani et al. 2011; Garcia-Aloy et al. 2014b). Tot i que ambdós marcadors podrien
tenir un origen exogen (dietètic), queda per aclarir si aquests podrien provenir del metaboloma endogen, degut a la importància del paper de la serotonina en la regulació del
balanç energètic, i en el metabolisme i l’homeòstasi de la glucosa.
Finalment, pel que fa als marcadors endògens associats amb el consum del cacau, en les
publicacions 4 i 5 (Llorach et al. 2013; Garcia-Aloy et al. 2014c) es va observar una
relació inversa entre la ingesta de cacau i les excrecions urinàries d’acilcarnitines. A causa
Discussió general
269
de la potencial funció d’aquesta classe de compostos en la resistència a la insulina
(Schooneman et al. 2013), aquesta associació podria estar indicant un possible mecanisme d’acció implicat en els efectes beneficiosos de la ingesta de cacau observats en els
estudis epidemiològics (Hooper et al. 2012).
Aquests resultats posen en relleu el valor de l’aproximació metabolòmica no dirigida
lliure d’hipòtesis, ja que pot promoure nous descobriments que poden ser útils en la interpretació dels possibles mecanismes pels quals els components de la dieta han estat
prèviament relacionats amb la salut humana en estudis epidemiològics.
11.5. Perspectives de futur
L’aplicació de la metabolòmica en els marcadors d’exposició encara està lluny de ser
explorada a fons. Per exemple, fins ara la major part dels estudis metabolòmics han estat
de tipus exploratori, pel que per alguns marcadors hi ha molt pocs estudis amb els que
poder comparar els resultats. Per aquest motiu és molt important seguir replicant els marcadors en diferents poblacions i en estudis amb dissenys diferenciats.
També calen estudis dirigits sobre el comportament dosi-resposta i les diferències interindividuals abans que els biomarcadors d’exposició puguin ser aplicats en estudis nutricionals de manera rutinària. De fet, el màxim aprofitament de les dades obtingudes a través
dels estudis metabolòmics s’obté quan es combinen anàlisis qualitatius i quantitatius, ja
que les mesures quantitatives dels marcadors mitjançant un enfocament dirigit i en un
estudi controlat milloren la seva aplicabilitat, així com interpretació. El coneixement de
la identitat d’un metabòlit i les seves pertorbacions quantitatives proporcionarà informació que pot ser molt útil en la interpretació de les vies metabòliques afectades (Dettmer
et al. 2007).
S’han realitzat alguns estudis metabolòmics per identificar marcadors dels patrons dietètics habituals (O'Sullivan et al. 2011; Andersen et al. 2014b), però els estudis són massa
diferents en el disseny i aproximació analítica per comparar si hi ha alguna coherència en
els patrons dietètics que s’han trobat i els metabòlits associats. Els resultats d’aquests
estudis demostren que el patró alimentari es reflecteix en l’orina i el plasma, tot i que és
270
Discussió i Conclusions
necessari plantejar nous estudis enfocats a la determinació de l’empremta inherent a
aquest consum d’aliments per reforçar el seu poder predictiu.
El desafiament més recentment proposat inclou la integració de les diferents tecnologies
òmiques (genòmica, proteòmica, transcriptòmica i metabolòmica) per obtenir una imatge
més completa de l’estat de salut i, d’aquesta manera, desentranyar els vincles entre la
prevenció de malalties i la ingesta dietètica. D’aquesta manera, en futurs estudis, la comprensió integral dels efectes de la dieta necessita aproximacions de la biologia de sistemes, incloent la genòmica, la proteòmica, la transcriptòmica i la metabolòmica, combinades amb un disseny experimental adequat i un nombre d’individus inclosos suficient
que sigui capaç de trobar les variables associades amb els efectes relacionats amb la dieta.
Aquests estudis requeriran de xarxes i equips de treball entre grups d’estudi multidisciplinaris.
A la vegada, també seria interessant analitzar les relacions existents entre els marcadors
de salut clàssics i els biomarcadors mesurats mitjançant els estudis metabolòmics no dirigits, amb l’objectiu de desxifrar la connexió biològica existent entre els marcadors tradicionals i els marcadors del metaboloma.
Conclusions
La principal conclusió que s’extreu d’aquest treball és que l’aplicació d’una estratègia
metabolòmica no dirigida en l’estudi de biomarcadors nutricionals permet caracteritzar
les principals diferències en el metaboloma urinari associades amb la ingesta dietètica.
Aquestes associacions s’evidencien en estudis d’intervenció i observacionals.
Les principals diferències observades en el metaboloma urinari s’associen amb la digestió
dels aliments, el metabolisme microbià i el metabolisme endogen.
De manera més concreta, i tenint en compte els objectius prèviament plantejats, els resultats obtinguts a partir dels diversos treballs que formen part de la present Tesi Doctoral
deriven en les següents conclusions específiques:
1. L’empremta metabòlica urinària està altament relacionada amb els aliments consumits. Concretament:

L’empremta metabòlica del consum diari de pa es caracteritza per compostos procedents dels fitoquímics propis dels cereals, com els metabòlits
dels benzoxazinoids i alquilresorcinols; per compostos produïts per la microbiota, com els metabòlits de les enterolactones, àcid hidroxibenzoic i
àcid dihidroferúlic; així com per altres compostos com la pirralina, l’àcid
3-indolcarboxílic glucurònid i la riboflavina. A la vegada, entre els consumidors de pa integral es va observar una major i menor excreció de 2,8dihidroxiquinolina glucurònid i N-α-acetilcitrulina, respectivament, els
quals podrien estar implicats en els efectes beneficiosos associats a la ingesta de pa integral observats prèviament en estudis epidemiològics.

L’empremta metabòlica del consum habitual de fruita seca, i més concretament de les nous, es caracteritza per marcadors del metabolisme dels
àcids grassos, compostos derivats del metabolisme dels el·lagitanins per
part de la microbiota, així com per compostos de la ruta metabòlica del
272
Discussió i Conclusions
triptòfan i de la serotonina. La importància de la identificació d’aquesta
darrera classe de compostos rau en el paper de la serotonina en la regulació
del balanç energètic, i en el metabolisme i l’homeòstasi de la glucosa.

L’empremta metabòlica del consum habitual de cacau es caracteritza per
compostos del metabolisme de la teobromina i dels polifenols, així com
per metabòlits relacionats amb el processament del cacau. El consum de
cacau també s’ha associat amb unes excrecions urinàries reduïdes de metabòlits relacionats amb el metabolisme de les acilcarnitines i de la sulfatació de la tirosina, els quals podrien estar relacionats amb la malaltia cardiovascular, tot i que són necessaris estudis específics per avaluar si els
canvis en aquests marcadors són conseqüència d’alguna alteració metabòlica associada a la ingesta de cacau, o bé són causades per una regulació
disminuïda o augmentada d’algunes vies metabòliques que els afecten.
2. Gran part dels biomarcadors caracteritzats en assajos clínics d’intervenció nutricional han estat replicats en individus avaluats de manera observacional en condicions de vida lliure. De forma majoritària, els biomarcadors que es mantenen
significatius com a discriminatoris es caracteritzen per ser aquells que solen presentar una excreció urinària a mig i llarg termini respecte al moment de la ingesta
del corresponent aliment.
3. L’anàlisi de regressió logística per passos permet la combinació de diferents metabòlits amb capacitat discriminatòria per al consum de determinats aliments que
es caracteritza per estar formada per compostos de diferent naturalesa que podrien
aportar informació complementària.
4. La capacitat predictiva de l’exposició dietètica a través dels models combinats
multi-metabòlit es veu millorada en comparació amb la capacitat dels mateixos
compostos avaluats de manera individual. Els models combinats podrien ser de
gran utilitat en la millora de la precisió durant l’avaluació de la ingesta dietètica.
La nutrimetabolòmica ens podria revelar alguns dels mecanismes d’acció que permetrien
explicar els efectes dels components de la dieta observats prèviament en estudis epidemiològics i, d’aquesta manera, contribuir a la generació de noves hipòtesis en el camp de
l’alimentació i la salut.
Referències
Referències bibliogràfiques
AbuMweis, S.S.; Jew, S.; Jones, P.J. (2010). Optimizing clinical trial design for assessing
the efficacy of functional foods. Nutrition Reviews, 68 (8): 485-499.
Andersen, M.B. (2013). Discovery of food exposure markers in urine and evaluation of
dietary compliance by untargeted LC-MS metabolomics. [Tesi doctoral].
Universitat de Copenhagen (Dinamarca).
Andersen, M.B.; Kristensen, M.; Manach, C.; Pujos-Guillot, E.; Poulsen, S.K.; Larsen,
T.M., et al. (2014a). Discovery and validation of urinary exposure markers for
different plant foods by untargeted metabolomics. Analytical and Bioanalytical
Chemistry, 406 (7): 1829-1844.
Andersen, M.B.; Rinnan, A.; Manach, C.; Poulsen, S.K.; Pujos-Guillot, E.; Larsen, T.M.,
et al. (2014b). Untargeted metabolomics as a screening tool for estimating
compliance to a dietary pattern. Journal of Proteome Research, 13 (3): 14051418.
Beckmann, M.; Lloyd, A.J.; Haldar, S.; Fave, G.; Seal, C.J.; Brandt, K., et al. (2013).
Dietary exposure biomarker-lead discovery based on metabolomics analysis of
urine samples. Proceedings of the Nutrition Society, 72 (3): 352-361.
Bingham, S.A. (2002). Biomarkers in nutritional epidemiology. Public Health Nutrition,
5 (6A): 821-827.
Bingham, S.A.; Luben, R.; Welch, A.; Wareham, N.; Khaw, K.T.; Day, N. (2003). Are
imprecise methods obscuring a relation between fat and breast cancer? Lancet,
362 (9379): 212-214.
276
Referències
Biomarkers Definitions Working Group (2001). Biomarkers and surrogate endpoints:
preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology &
Therapeutics, 69 (3): 89-95.
Boto-Ordonez, M.; Rothwell, J.A.; Andres-Lacueva, C.; Manach, C.; Scalbert, A.; UrpiSarda, M. (2014). Prediction of the wine polyphenol metabolic space: an
application of the Phenol-Explorer database. Molecular Nutrition & Food
Research, 58 (3): 466-477.
Bryan, K.; Brennan, L.; Cunningham, P. (2008). MetaFIND: A feature analysis tool for
metabolomics data. BMC Bioinformatics, 9 (1): 470.
Casas-Agustench, P.; Lopez-Uriarte, P.; Bullo, M.; Ros, E.; Cabre-Vila, J.J.; SalasSalvado, J. (2011). Effects of one serving of mixed nuts on serum lipids, insulin
resistance and inflammatory markers in patients with the metabolic syndrome.
Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases, 21 (2): 126-135.
Chanock, S.J.; Manolio, T.; Boehnke, M.; Boerwinkle, E.; Hunter, D.J.; Thomas, G., et
al. (2007). Replicating genotype-phenotype associations. Nature, 447 (7145):
655-660.
Chen, Y.; Ross, A.B.; Aman, P.; Kamal-Eldin, A. (2004). Alkylresorcinols as markers of
whole grain wheat and rye in cereal products. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 52 (26): 8242-8246.
Dauchet, L.; Montaye, M.; Ruidavets, J.B.; Arveiler, D.; Kee, F.; Bingham, A., et al.
(2010). Association between the frequency of fruit and vegetable consumption
and cardiovascular disease in male smokers and non-smokers. European Journal
of Clinical Nutrition, 64 (6): 578-586.
Dettmer, K.; Aronov, P.A.; Hammock, B.D. (2007). Mass spectrometry-based
metabolomics. Mass Spectrometry Reviews, 26 (1): 51-78.
Dunn, W.B.; Erban, A.; Weber, R.J.M.; Creek, D.J.; Brown, M.; Breitling, R., et al.
(2013). Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused
untargeted metabolomics. Metabolomics, 9 (S1): 44-66.
Referències bibliogràfiques
277
EFSA (2014). Technical meeting on the reporting of human studies submitted for the
scientific substantiation of health claims [en línia]. EFSA Supporting Publication:
EN-569 [Consulta: 11 Juny 2014]. Disponible a: http://www.efsa.europa.eu/en/
supporting/doc/569e.pdf.
Eriksson, L.; Byrne, T.; Johansson, E.; Trygg, J.; Vikström, C. (ed.) (2013). Multi- and
Megavariate Data Analysis: Basics Principles and Applications. 3a ed. Suècia:
Umetrics Academy. ISBN: 978-91-973730-5-0.
Espin, J.C.; Larrosa, M.; Garcia-Conesa, M.T.; Tomas-Barberan, F. (2013). Biological
significance of urolithins, the gut microbial ellagic acid-derived metabolites: The
evidence so far. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013
(Article ID 270418): 15 pages.
Estruch, R.; Ros, E.; Salas-Salvado, J.; Covas, M.I.; Corella, D.; Aros, F., et al. (2013).
Primary prevention of cardiovascular disease with a Mediterranean diet. New
England Journal of Medicine, 368 (14): 1279-1290.
Fardet, A.; Llorach, R.; Orsoni, A.; Martin, J.F.; Pujos-Guillot, E.; Lapierre, C., et al.
(2008). Metabolomics provide new insight on the metabolism of dietary
phytochemicals in rats. Journal of Nutrition, 138 (7): 1282-1287.
Fernandez-Albert, F.; Llorach, R.; Andres-Lacueva, C.; Perera, A. (2014). An R package
to analyse LC/MS metabolomic data: MAIT (Metabolite Automatic Identification
Toolkit). Bioinformatics, 30 (13): 1937-1939.
Fernandez-Albert, F.; Llorach, R.; Garcia-Aloy, M.; Ziyatdinov, A.; Andres-Lacueva, C.;
Perera, A. (2014). Intensity drift removal in LC/MS metabolomics by Common
Variance Compensation. Bioinformatics [en premsa]. doi: 10.1093/bioinformatics/btu423.
Fernandez-Ballart, J.D.; Pinol, J.L.; Zazpe, I.; Corella, D.; Carrasco, P.; Toledo, E., et al.
(2010). Relative validity of a semi-quantitative food-frequency questionnaire in
an elderly Mediterranean population of Spain. British Journal of Nutrition, 103
(12): 1808-1816.
278
Referències
Fiehn, O. (2002). Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant
Molecular Biology, 48 (1-2): 155-171.
Garcia-Aloy, M.; Llorach, R.; Urpi-Sarda, M.; Tulipani, S.; Salas-Salvado, J.; MartinezGonzalez, M.A., et al. (2014a). Nutrimetabolomics fingerprinting to identify
biomarkers of bread exposure in a free-living population from the PREDIMED
study cohort. Metabolomics [en premsa]. doi: 10.1007/s11306-014-0682-6.
Garcia-Aloy, M.; Llorach, R.; Urpi-Sarda, M.; Tulipani, S.; Estruch, R.; MartinezGonzalez, M.A., et al. (2014b). Novel multi-metabolite prediction of walnut
consumption by a urinary biomarker model in a free-living population: the
PREDIMED study. Journal of Proteome Research, 13 (7): 3476-3483.
Garcia-Aloy, M.; Llorach, R.; Urpi-Sarda, M.; Jauregui, O.; Salas-Salvadó, J.; MartinezGonzalez, M.A., et al. (2014c). Untargeted metabolomics approach to obtain a
metabolic footprint of regular dietary consumption by designing models of
combined urinary biomarkers: Cocoa product intake in free-living subjects from
the PREDIMED study. [En procés de publicació].
Garcia-Munoz, C.; Vaillant, F. (2014). Metabolic fate of ellagitannins: implications for
health, and research perspectives for innovative functional foods. Critical Reviews
in Food Science and Nutrition, 54 (12): 1584-1598.
Gibney, M.J.; Walsh, M.; Brennan, L.; Roche, H.M.; German, B.; van Ommen, B. (2005).
Metabolomics in human nutrition: opportunities and challenges. American
Journal of Clinical Nutrition, 82 (3): 497-503.
Gika, H.G.; Theodoridis, G.A.; Wilson, I.D. (2008). Liquid chromatography and ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry fingerprinting of human
urine: sample stability under different handling and storage conditions for
metabonomics studies. Journal of Chromatography A, 1189 (1-2): 314-322.
Grundy, S.M. (2005). Metabolic syndrome scientific statement by the American Heart
Association and the National Heart, Lung, and Blood Institute. Arteriosclerosis,
Thrombosis, and Vascular Biology, 25 (11): 2243-2244.
Referències bibliogràfiques
279
He, M.; van Dam, R.M.; Rimm, E.; Hu, F.B.; Qi, L. (2010). Whole-grain, cereal fiber,
bran, and germ intake and the risks of all-cause and cardiovascular diseasespecific mortality among women with type 2 diabetes mellitus. Circulation, 121
(20): 2162-2168.
Heinzmann, S.S.; Brown, I.J.; Chan, Q.; Bictash, M.; Dumas, M.E.; Kochhar, S., et al.
(2010). Metabolic profiling strategy for discovery of nutritional biomarkers:
proline betaine as a marker of citrus consumption. American Journal of Clinical
Nutrition, 92 (2): 436-443.
Holcapek, M. (2014). Mass Analyzers [en línia]. Amsterdam (Països Baixos): Chromedia
[Consulta: 20 abril 2014]. Disponible a: http://www.chromedia.org/chromedia?
waxtrapp=thcseDsHqnOxmOlIEcCvB&subNav=oibelDsHqnOxmOlIEcCvBG.
Hooper, L.; Kay, C.; Abdelhamid, A.; Kroon, P.A.; Cohn, J.S.; Rimm, E.B., et al. (2012).
Effects of chocolate, cocoa, and flavan-3-ols on cardiovascular health: a
systematic review and meta-analysis of randomized trials. American Journal of
Clinical Nutrition, 95 (3): 740-751.
Horai, H.; Arita, M.; Kanaya, S.; Nihei, Y.; Ikeda, T.; Suwa, K., et al. (2010). MassBank:
a public repository for sharing mass spectral data for life sciences. Journal of Mass
Spectrometry, 45 (7): 703-714.
Hu, F.B.; Manson, J.E.; Stampfer, M.J.; Colditz, G.; Liu, S.; Solomon, C.G., et al. (2001).
Diet, lifestyle, and the risk of type 2 diabetes mellitus in women. New England
Journal of Medicine, 345 (11): 790-797.
Jenab, M.; Slimani, N.; Bictash, M.; Ferrari, P.; Bingham, S.A. (2009). Biomarkers in
nutritional epidemiology: applications, needs and new horizons. Human Genetics,
125 (5-6): 507-525.
Jia, L.; Liu, X.; Bai, Y.Y.; Li, S.H.; Sun, K.; He, C., et al. (2010). Short-term effect of
cocoa product consumption on lipid profile: a meta-analysis of randomized
controlled trials. American Journal of Clinical Nutrition, 92 (1): 218-225.
Kaaks, R.; Ferrari, P. (2006). Dietary intake assessments in epidemiology: can we know
what we are measuring? Annals of Epidemiology, 16 (5): 377-380.
280
Referències
Kanehisa, M.; Goto, S.; Sato, Y.; Furumichi, M.; Tanabe, M. (2012). KEGG for
integration and interpretation of large-scale molecular data sets. Nucleic Acids
Research, 40 (Database Issue): D109-114.
Khan, N.; Khymenets, O.; Urpi-Sarda, M.; Tulipani, S.; Garcia-Aloy, M.; Monagas, M.,
et al. (2014). Cocoa polyphenols and inflammatory markers of cardiovascular
disease. Nutrients, 6 (2): 844-880.
Krauss, R.M.; Eckel, R.H.; Howard, B.; Appel, L.J.; Daniels, S.R.; Deckelbaum, R.J., et
al. (2000). AHA Dietary Guidelines: revision 2000: A statement for healthcare
professionals from the Nutrition Committee of the American Heart Association.
Circulation, 102 (18): 2284-2299.
Kris-Etherton, P.M.; Hecker, K.D.; Bonanome, A.; Coval, S.M.; Binkoski, A.E.; Hilpert,
K.F., et al. (2002). Bioactive compounds in foods: their role in the prevention of
cardiovascular disease and cancer. American Journal of Medicine, 113 (Suppl
9B): 71-88.
Kristal, A.R.; Peters, U.; Potter, J.D. (2005). Is it time to abandon the food frequency
questionnaire? Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 14 (12): 28262828.
Levsen, K.; Schiebel, H.M.; Terlouw, J.K.; Jobst, K.J.; Elend, M.; Preiss, A., et al. (2007).
Even-electron ions: a systematic study of the neutral species lost in the
dissociation of quasi-molecular ions. Journal of Mass Spectrometry, 42 (8): 10241044.
Livingstone, M.B.; Black, A.E. (2003). Markers of the validity of reported energy intake.
Journal of Nutrition, 133 (Suppl 3): 895S-920S.
Llorach, R.; Urpi-Sarda, M.; Jauregui, O.; Monagas, M.; Andres-Lacueva, C. (2009). An
LC-MS-based metabolomics approach for exploring urinary metabolome
modifications after cocoa consumption. Journal of Proteome Research, 8 (11):
5060-5068.
Referències bibliogràfiques
281
Llorach, R.; Garrido, I.; Monagas, M.; Urpi-Sarda, M.; Tulipani, S.; Bartolome, B., et al.
(2010). Metabolomics study of human urinary metabolome modifications after
intake of almond (Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb) skin polyphenols. Journal of
Proteome Research, 9 (11): 5859-5867.
Llorach, R.; Garcia-Aloy, M.; Tulipani, S.; Vazquez-Fresno, R.; Andres-Lacueva, C.
(2012). Nutrimetabolomic strategies to develop new biomarkers of intake and
health effects. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60 (36): 8797-8808.
Llorach, R.; Urpi-Sarda, M.; Tulipani, S.; Garcia-Aloy, M.; Monagas, M.; AndresLacueva, C. (2013). Metabolomic fingerprint in patients at high risk of
cardiovascular disease by cocoa intervention. Molecular Nutrition & Food
Research, 57 (6): 962-973.
Llorach-Asuncion, R.; Jauregui, O.; Urpi-Sarda, M.; Andres-Lacueva, C. (2010).
Methodological aspects for metabolome visualization and characterization: a
metabolomic evaluation of the 24 h evolution of human urine after cocoa powder
consumption. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 51 (2): 373-381.
Lloyd, A.J.; Beckmann, M.; Fave, G.; Mathers, J.C.; Draper, J. (2011). Proline betaine
and its biotransformation products in fasting urine samples are potential
biomarkers of habitual citrus fruit consumption. British Journal of Nutrition, 106
(6): 812-824.
Lloyd, A.J.; Beckmann, M.; Haldar, S.; Seal, C.; Brandt, K.; Draper, J. (2013). Datadriven strategy for the discovery of potential urinary biomarkers of habitual
dietary exposure. American Journal of Clinical Nutrition, 97 (2): 377-389.
Lopez-Uriarte, P.; Nogues, R.; Saez, G.; Bullo, M.; Romeu, M.; Masana, L., et al. (2010).
Effect of nut consumption on oxidative stress and the endothelial function in
metabolic syndrome. Clinical Nutrition, 29 (3): 373-380.
Manach, C.; Hubert, J.; Llorach, R.; Scalbert, A. (2009). The complex links between
dietary phytochemicals and human health deciphered by metabolomics.
Molecular Nutrition & Food Research, 53 (10): 1303-1315.
282
Referències
Martínez-González, M.a. (ed.) (2006). Bioestadística Amigable. 2a ed. Pamplona: Díaz
de Santos. ISBN: 8479787910.
Martinez-Gonzalez, M.A.; Corella, D.; Salas-Salvado, J.; Ros, E.; Covas, M.I.; Fiol, M.,
et al. (2012). Cohort profile: design and methods of the PREDIMED study.
International Journal of Epidemiology, 41 (2): 377-385.
Martin-Moreno, J.M.; Boyle, P.; Gorgojo, L.; Maisonneuve, P.; Fernandez-Rodriguez,
J.C.; Salvini, S., et al. (1993). Development and validation of a food frequency
questionnaire in Spain. International Journal of Epidemiology, 22 (3): 512-519.
Mataix Verdú, J. (ed.) (2003). Tabla de Composición de Alimentos. 4a ed. Granada:
Universidad de Granada. ISBN: 8433830503.
McCullough, M.L.; Patel, A.V.; Kushi, L.H.; Patel, R.; Willett, W.C.; Doyle, C., et al.
(2011). Following cancer prevention guidelines reduces risk of cancer,
cardiovascular disease, and all-cause mortality. Cancer Epidemiology,
Biomarkers & Prevention, 20 (6): 1089-1097.
Monagas, M.; Khan, N.; Andres-Lacueva, C.; Casas, R.; Urpi-Sarda, M.; Llorach, R., et
al. (2009). Effect of cocoa powder on the modulation of inflammatory biomarkers
in patients at high risk of cardiovascular disease. American Journal of Clinical
Nutrition, 90 (5): 1144-1150.
Neveu, V.; Perez-Jimenez, J.; Vos, F.; Crespy, V.; du Chaffaut, L.; Mennen, L., et al.
(2010). Phenol-Explorer: an online comprehensive database on polyphenol
contents in foods. Database (Oxford), 2010: bap024.
Nigg, C.R.; Burbank, P.M.; Padula, C.; Dufresne, R.; Rossi, J.S.; Velicer, W.F., et al.
(1999). Stages of change across ten health risk behaviors for older adults.
Gerontologist, 39 (4): 473-482.
Oliver, S.G.; Winson, M.K.; Kell, D.B.; Baganz, F. (1998). Systematic functional
analysis of the yeast genome. Trends in Biotechnology, 16 (9): 373-378.
Referències bibliogràfiques
283
OMS (1993). Biomarkers and risk assessment: concepts and principles [en línia].
Gènova: Organització Mundial de la Salut [Consulta: 14 abril 2014]. Disponible
a: http://apps.who.int/iris/handle/10665/39037. ISBN: 9241571551.
OMS (2011). Global Status Report on Noncommunicable Diseases 2010 [en línia].
Organització Mundial de la Salut [Consulta: 14 abril 2014]. Disponible a:
http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789240686458_eng.pdf. ISBN: 978
9241564229.
Oresic, M. (2009). Metabolomics, a novel tool for studies of nutrition, metabolism and
lipid dysfunction. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases, 19 (11):
816-824.
Ortiz-Andrellucchi, A.; Doreste-Alonso, J.; Henriquez-Sanchez, P.; Cetin, I.; SerraMajem, L. (2009). Dietary assessment methods for micronutrient intake in
pregnant women: a systematic review. British Journal of Nutrition, 102 (Suppl 1):
S64-86.
Osakabe, N.; Yasuda, A.; Natsume, M.; Takizawa, T.; Terao, J.; Kondo, K. (2002).
Catechins and their oligomers linked by C4 --> C8 bonds are major cacao
polyphenols and protect low-density lipoprotein from oxidation in vitro.
Experimental Biology and Medicine, 227 (1): 51-56.
O'Sullivan, A.; Gibney, M.J.; Brennan, L. (2011). Dietary intake patterns are reflected in
metabolomic profiles: potential role in dietary assessment studies. American
Journal of Clinical Nutrition, 93 (2): 314-321.
Pardo, A.; Ruiz, M.A. (2001). Análisis de regresión lineal: el procedimiento Regresión
Lineal [en línia]. Madrid: Departamento de Sociología (Universidad Complutense
de Madrid) [Consulta: 21 abril 2014]. Disponible a: http://pendientedemigracion.
ucm.es/info/socivmyt/paginas/D_departamento/materiales/analisis_datosyMultiv
ariable/18reglin_SPSS.pdf.
Potischman, N. (2003). Biologic and methodologic issues for nutritional biomarkers.
Journal of Nutrition, 133 (Suppl 3): 875S-880S.
284
Referències
Potischman, N.; Freudenheim, J.L. (2003). Biomarkers of nutritional exposure and
nutritional status: an overview. Journal of Nutrition, 133 (Suppl 3): 873S-874S.
Pujos-Guillot, E.; Hubert, J.; Martin, J.F.; Lyan, B.; Quintana, M.; Claude, S., et al.
(2013). Mass spectrometry-based metabolomics for the discovery of biomarkers
of fruit and vegetable intake: citrus fruit as a case study. Journal of Proteome
Research, 12 (4): 1645-1659.
R Core Team (2014). R: A language and environment for statistical computing [en línia].
Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing. Disponible a: http://
www.R-project.org/.
Rein, D.; Paglieroni, T.G.; Wun, T.; Pearson, D.A.; Schmitz, H.H.; Gosselin, R., et al.
(2000). Cocoa inhibits platelet activation and function. American Journal of
Clinical Nutrition, 72 (1): 30-35.
Rezzi, S.; Ramadan, Z.; Fay, L.B.; Kochhar, S. (2007). Nutritional metabonomics:
applications and perspectives. Journal of Proteome Research, 6 (2): 513-525.
Richardson, D.P.; Affertsholt, T.; Asp, N.G.; Bruce, A.; Grossklaus, R.; Howlett, J., et al.
(2003). PASSCLAIM - Synthesis and review of existing processes. European
Journal of Nutrition, 42 (Suppl 1): I96-111.
Richelle, M.; Tavazzi, I.; Offord, E. (2001). Comparison of the antioxidant activity of
commonly consumed polyphenolic beverages (coffee, cocoa, and tea) prepared
per cup serving. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (7): 3438-3442.
Ried, K.; Sullivan, T.R.; Fakler, P.; Frank, O.R.; Stocks, N.P. (2012). Effect of cocoa on
blood pressure. Cochrane Database of Systematic Reviews, 8: CD008893.
Rodopoulos, N.; Hojvall, L.; Norman, A. (1996). Elimination of theobromine metabolites
in healthy adults. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation,
56 (4): 373-383.
Referències bibliogràfiques
285
Rothwell, J.A.; Urpi-Sarda, M.; Boto-Ordonez, M.; Knox, C.; Llorach, R.; Eisner, R., et
al. (2012). Phenol-Explorer 2.0: a major update of the Phenol-Explorer database
integrating data on polyphenol metabolism and pharmacokinetics in humans and
experimental animals. Database (Oxford), 2012: bas031.
Rothwell, J.A.; Perez-Jimenez, J.; Neveu, V.; Medina-Remon, A.; M'Hiri, N.; GarciaLobato, P., et al. (2013). Phenol-Explorer 3.0: a major update of the PhenolExplorer database to incorporate data on the effects of food processing on
polyphenol content. Database (Oxford), 2013: bat070.
Saccenti, E.; Hoefsloot, H.J.; Smilde, A.; Westerhuis, J.; Hendriks, M.W.B. (2014).
Reflections on univariate and multivariate analysis of metabolomics data.
Metabolomics, 10 (3): 361-374.
Scalbert, A.; Brennan, L.; Fiehn, O.; Hankemeier, T.; Kristal, B.S.; van Ommen, B., et al.
(2009). Mass-spectrometry-based metabolomics: limitations and recommendations for future progress with particular focus on nutrition research. Metabolomics, 5 (4): 435-458.
Scalbert, A.; Brennan, L.; Manach, C.; Andres-Lacueva, C.; Dragsted, L.O.; Draper, J.,
et al. (2014). The food metabolome: a window over dietary exposure. American
Journal of Clinical Nutrition, 99 (6): 1286-1308.
Schooneman, M.G.; Vaz, F.M.; Houten, S.M.; Soeters, M.R. (2013). Acylcarnitines:
reflecting or inflicting insulin resistance? Diabetes, 62 (1): 1-8.
Schroder, H.; Covas, M.I.; Marrugat, J.; Vila, J.; Pena, A.; Alcantara, M., et al. (2001).
Use of a three-day estimated food record, a 72-hour recall and a food-frequency
questionnaire for dietary assessment in a Mediterranean Spanish population.
Clinical Nutrition, 20 (5): 429-437.
Schroeter, H.; Heiss, C.; Balzer, J.; Kleinbongard, P.; Keen, C.L.; Hollenberg, N.K., et
al. (2006). (-)-Epicatechin mediates beneficial effects of flavanol-rich cocoa on
vascular function in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, 103 (4): 1024-1029.
286
Referències
Schulte, P.A. (2005). The use of biomarkers in surveillance, medical screening, and
intervention. Mutation Research, 592 (1-2): 155-163.
Smith, C.A.; O'Maille, G.; Want, E.J.; Qin, C.; Trauger, S.A.; Brandon, T.R., et al.
(2005). METLIN: a metabolite mass spectral database. Therapeutic Drug
Monitoring, 27 (6): 747-751.
Spencer, J.P.; Abd El Mohsen, M.M.; Minihane, A.M.; Mathers, J.C. (2008). Biomarkers
of the intake of dietary polyphenols: strengths, limitations and application in
nutrition research. British Journal of Nutrition, 99 (1): 12-22.
Stampfer, M.J.; Hu, F.B.; Manson, J.E.; Rimm, E.B.; Willett, W.C. (2000). Primary
prevention of coronary heart disease in women through diet and lifestyle. New
England Journal of Medicine, 343 (1): 16-22.
Stanstrup, J. (2014). Metabolomics investigation of whey intake: discovery of markers
and biological effects supported by a computer-assisted compound identification
pipeline. [Tesi doctoral]. Universitat de Copenhagen (Dinamarca).
Sud, M.; Fahy, E.; Cotter, D.; Brown, A.; Dennis, E.A.; Glass, C.K., et al. (2007). LMSD:
LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research, 35 (Database Issue):
D527-532.
Sumner, L.W.; Amberg, A.; Barrett, D.; Beale, M.H.; Beger, R.; Daykin, C.A., et al.
(2007). Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical
Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI).
Metabolomics, 3 (3): 211-221.
Tautenhahn, R.; Cho, K.; Uritboonthai, W.; Zhu, Z.; Patti, G.J.; Siuzdak, G. (2012). An
accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN database.
Nature Biotechnology, 30 (9): 826-828.
Theodoridis, G.A.; Gika, H.G.; Want, E.J.; Wilson, I.D. (2012). Liquid chromatographymass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Analytica Chimica
Acta, 711: 7-16.
Referències bibliogràfiques
287
Tikunov, Y.; Lommen, A.; de Vos, C.H.; Verhoeven, H.A.; Bino, R.J.; Hall, R.D., et al.
(2005). A novel approach for nontargeted data analysis for metabolomics. Largescale profiling of tomato fruit volatiles. Plant Physiology, 139 (3): 1125-1137.
Tousoulis, D.; Antoniades, C.; Tentolouris, C.; Goumas, G.; Stefanadis, C.; Toutouzas,
P. (2002). L-arginine in cardiovascular disease: dream or reality? Vascular
Medicine, 7 (3): 203-211.
Trespalacios, M.P.; Tulipani, S.; Garcia-Aloy, M.; Zamora-Ros, R.; Rotches-Ribalta, M.;
Rabassa, M., et al. (2013). Nutritional Biomarkers: Applications and Challenges.
A: Morrisson, J.L. Food Intake: Regulation, Assessing and Controlling. Nova
Science Publishers, Inc. ISBN: 9781613241837.
Trygg, J.; Holmes, E.; Lundstedt, T. (2007). Chemometrics in metabonomics. Journal of
Proteome Research, 6 (2): 469-479.
Tulipani, S.; Llorach, R.; Jauregui, O.; Lopez-Uriarte, P.; Garcia-Aloy, M.; Bullo, M., et
al. (2011). Metabolomics unveils urinary changes in subjects with metabolic
syndrome following 12-week nut consumption. Journal of Proteome Research,
10 (11): 5047-5058.
Urpi-Sarda, M.; Monagas, M.; Khan, N.; Llorach, R.; Lamuela-Raventos, R.M.; Jauregui,
O., et al. (2009). Targeted metabolic profiling of phenolics in urine and plasma
after regular consumption of cocoa by liquid chromatography-tandem mass
spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216 (43): 7258-7267.
van den Berg, R.A.; Hoefsloot, H.C.; Westerhuis, J.A.; Smilde, A.K.; van der Werf, M.J.
(2006). Centering, scaling, and transformations: improving the biological
information content of metabolomics data. BMC Genomics, 7: 142.
Westerhuis, J.; Hoefsloot, H.J.; Smit, S.; Vis, D.; Smilde, A.; Velzen, E.J., et al. (2008).
Assessment of PLSDA cross validation. Metabolomics, 4 (1): 81-89.
Wiklund, S.; Johansson, E.; Sjostrom, L.; Mellerowicz, E.J.; Edlund, U.; Shockcor, J.P.,
et al. (2008). Visualization of GC/TOF-MS-Based Metabolomics Data for
Identification of Biochemically Interesting Compounds Using OPLS Class
Models. Analytical Chemistry, 80 (1): 115-122.
288
Referències
Wishart, D.S.; Tzur, D.; Knox, C.; Eisner, R.; Guo, A.C.; Young, N., et al. (2007).
HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research, 35 (Database
Issue): D521-526.
Wishart, D.S. (2008). Metabolomics: applications to food science and nutrition research.
Trends in Food Science & Technology, 19 (9): 482-493.
Wishart, D.S.; Knox, C.; Guo, A.C.; Eisner, R.; Young, N.; Gautam, B., et al. (2009).
HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Research,
37 (Database Issue): D603-610.
Wishart, D.S.; Jewison, T.; Guo, A.C.; Wilson, M.; Knox, C.; Liu, Y., et al. (2013).
HMDB 3.0--The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Research,
41 (Database Issue): D801-807.
Wold, S.; Sjostrom, M.; Eriksson, L. (2001). PLS-regression: a basic tool of
chemometrics. Chemometrics & Intelligent Laboratory Systems, 58 (2): 109 - 130.
Wolf, S.; Schmidt, S.; Muller-Hannemann, M.; Neumann, S. (2010). In silico
fragmentation for computer assisted identification of metabolite mass spectra.
BMC Bioinformatics, 11: 148.
Xia, J.; Broadhurst, D.I.; Wilson, M.; Wishart, D.S. (2013). Translational biomarker
discovery in clinical metabolomics: an introductory tutorial. Metabolomics, 9 (2):
280-299.
Zamora-Ros, R.; Urpi-Sarda, M.; Lamuela-Raventos, R.M.; Estruch, R.; MartinezGonzalez, M.A.; Bullo, M., et al. (2009). Resveratrol metabolites in urine as a
biomarker of wine intake in free-living subjects: The PREDIMED Study. Free
Radical Biology and Medicine, 46 (12): 1562-1566.
Zamora-Ros, R.; Rabassa, M.; Cherubini, A.; Urpi-Sarda, M.; Llorach, R.; Bandinelli, S.,
et al. (2011). Comparison of 24-h volume and creatinine-corrected total urinary
polyphenol as a biomarker of total dietary polyphenols in the Invecchiare
InCHIANTI study. Analytica Chimica Acta, 704 (1-2): 110-115.
Referències bibliogràfiques
289
Zhang, X.; Yap, Y.; Wei, D.; Chen, G.; Chen, F. (2008). Novel omics technologies in
nutrition research. Biotechnology Advances, 26 (2): 169-176.
Zhen, Y.; Krausz, K.W.; Chen, C.; Idle, J.R.; Gonzalez, F.J. (2007). Metabolomic and
genetic analysis of biomarkers for peroxisome proliferator-activated receptor
alpha expression and activation. Molecular Endocrinology, 21 (9): 2136-2151.
Zhu, Z.J.; Schultz, A.W.; Wang, J.; Johnson, C.H.; Yannone, S.M.; Patti, G.J., et al.
(2013). Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry
characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nature
Protocols, 8 (3): 451-460.
Annex
Altres Publicacions en Revistes
Correcció de la deriva en la intensitat per a senyals de LC/MS
en metabolòmica mitjançant la Compensació de Variança Comuna
Publicació I: Francesc Fernández-Albert, Rafael Llorach, Mar Garcia-Aloy, Andrey
Ziyatdinov, Cristina Andrés-Lacueva, Alexandre Perera. Intensity drift removal in
LC/MS metabolomics by Common Variance Compensation. Bioinformatics. 2014 [en
premsa]. doi: 10.1093/bioinformatics/btu423.
En aquesta publicació es va proposar la introducció d’una metodologia basada en un
anàlisis de la variància observada durant l’etapa d’adquisició de dades metabolòmiques
en grans experiments LC-MS associada a la supressió d’ions, o als canvis en la sensibilitat i la intensitat. Aquest treball ha estat realitzat en col·laboració amb el grup
d’investigació del Doctor Alexandre Perera de la Universitat Politècnica de Catalunya.
Altres publicacions en revistes
295
296
Annex
Altres publicacions en revistes
297
298
Annex
Altres publicacions en revistes
299
300
Annex
Altres publicacions en revistes
301
302
Annex
Canvis en l’empremta metabòlica urinària després del consum
d’un probiòtic en dones amb mastitis
Publicació II: Rosa Vázquez-Fresno, Rafael Llorach, Jelena Marinic, Sara Tulipani, Mar
Garcia-Aloy, Irene Espinosa-Martos, Esther Jiménez, Juan Miguel Rodríguez, Cristina
Andrés-Lacueva. Urinary metabolomic fingerprinting after consumption of a probiotic
strain in women with mastitis. Pharmacological Research. 2014 [en premsa]. doi: 10.
1016/j.phrs.2014.05.010.
En aquesta publicació es va aplicar una aproximació metabolòmica mitjançant anàlisis
1
H-NMR per detectar les diferències metabolòmiques després del consum d’un probiòtic
(Lactobacillus salivarius PS2) en dones lactants amb mastitis gràcies a la col·laboració
amb el grup d’investigació del Doctor Juan Miguel Rodríguez de la Universidad Complutense de Madrid, dins del miniprojecte CONSOLIDER “Administració d’un probiòtic
en dones lactants: efectes microbiològics, immunològics, transcriptòmics i/o metabolòmics en la parella mare-fill”.
Altres publicacions en revistes
305
306
Annex
Altres publicacions en revistes
307
308
Annex
Altres publicacions en revistes
309
310
Annex
Altres publicacions en revistes
311
312
Annex
Altres publicacions en revistes
313
Altres Capítols de Llibre
Capítol de Llibre I: Rosa Vázquez-Fresno, Sara Tulipani, Olha Khymenets, Mireia UrpíSardà, Mar Garcia-Aloy, Montserrat Rabassa, Maria Boto-Ordóñez, Maria RotchésRibalta, Rafael Llorach, Cristina Andrés-Lacueva. Emerging Applications of
Metabolomics to Polyphenols and CVD Biomarker Discovery. A: Watson RR, Preedy
VR, Zibadi S (editors). Polyphenols in Human Health and Disease. Elsevier; 2014. ISBN:
978-0-12398-456-2.
Altres capítols de llibre
317
Capítol de Llibre II: Montserrat Rabassa, Raul Zamora-Ros, Sara Tulipani, Olha
Khymenets, Mireia Urpi-Sarda, Mar Garcia-Aloy, Maria Boto, Rosa Vázquez, Maria
Rotches-Ribalta, Gemma Chiva, María del Pilar Trespalacios, Rafael Llorach, Cristina
Andres-Lacueva. Flavonoids from food and its implication in human health. A: Yamane
K, Kato Y (editors): Handbook of flavonoids: dietary sources, properties and health
benefits. Nova Science Publishers; 2012. ISBN: 978-1-61942-052-6.
Altres capítols de llibre
319
Capítol de llibre III: María Boto-Ordoñez, Mireia Urpi-Sarda, Maria Monagas, Sara
Tulipani, Rafael Llorach, Montserrat Rabassa-Bonet, Mar Garcia-Aloy, María Isabel
Queipo-Ortuño, Ramon Estruch, Francisco Tinahones, Begoña Bartolomé, Cristina
Andres-Lacueva. Phenolic acids from microbial metabolism of dietary flavan-3-ols. A:
Munné-Bosch S (editor): Phenolic acids: composition, applications and health benefits.
Nova Science Publishers; 2012. ISBN: 978-1-61942-040-3.
320
Annex
Altres capítols de llibre
321
Capítol de llibre IV: Maria Rotches-Ribalta, Mireia Urpi-Sarda, Sara Tulipani, Pilar
Trespalacios, Montserrat Rabassa-Bonet, María Boto-Ordóñez, Rosa Vazquez-Fresno,
Mar Garcia-Aloy, Rafael Llorach, Cristina Andres-Lacueva. Metabolism and
pharmacokinetics of resveratrol: sources and food matrix on the bioavailability of
resveratrol. A: Delmas D (editor): Resveratrol: sources, production, and health benefits.
Nova Science Publishers; 2012. ISBN: 978-1-62081-997-5
SOURCES AND FOOD MATRIX ON THE
BIOAVAILABILITY OF RESVERATROL
Maria Rotches-Ribaltaa,b, Mireia Urpi-Sardac,d, Sara Tulipania,b,
Pilar Trespalaciosa,b, Olha Khymenetsa,b, Montse Rabassa-Boneta,b,
Maria Boto-Ordóñezc,d, Rosa Vazquez-Fresnoa,b, Mar
Garcia-Aloya,b, Rafael Lloracha,b and Cristina Andres-Lacuevaa,b
a
University of Barcelona, Av Joan XXIII, s/n, Barcelona, Spain.
b
Ministry of Science and Innovation, Barcelona, Spain
c
Institut d'Investigació Biomèdica August Pi i Sunyer, Barcelona, Spain
d
Instituto de Salud Carlos, Barcelona, Spain
ABSTRACT
Resveratrol consumption has been positively associated with the prevention of a number
of diseases, mainly due to its reported antioxidant activity and anti-inflammatory and
antitumor effects, and has, therefore, the potential to be evaluated for therapeutic use.
However, scarce studies have been carried out in humans and the results yielded are still
controversial. Before making nutritional recommendations regarding this promising
molecule, other aspects such as dietary intake and bioavailability should be considered.
Resveratrol and other stilbenes, such as piceid, have been identified in a large number of
plants, although they have been found in a few dietary components, with red wine and grape
products as the major sources. Therefore, urinary resveratrol metabolites have been described
as nutritional biomarkers of wine consumption, providing an additional tool for clinical and
epidemiological studies, since they reflect a more objective assessment of nutrient intake than
self-reported dietary data. Its estimated intake or exposure is essential in order to relate
resveratrol consumption with its possible health effects in vivo. However, resveratrol is
rapidly metabolized, and therefore the bioactivity of this compound will be related to its
metabolites. Identification and measurement of metabolic forms are key prerequisites for
understanding the role of these compounds, since they will be the ones that reach the
peripheral circulation and tissues where they could exert their biological effect. Phase II
metabolism of resveratrol has been widely studied, with the glucuronide and sulfate forms
being the main resveratrol conjugates. However, few studies have focused on the microbial
metabolism of resveratrol, which leads to dihydroresveratrol formation, although this could
give a better idea about effects of long-term resveratrol consumption. Furthermore, the matrix
in which resveratrol is delivered could play an important role in its bioavailability.
This chapter, therefore, provides an overview of the metabolism of resveratrol after
short- and long-term consumption and the microbiota and food matrix effects on its
bioavailability. This needs to be considered in order to gain a better understanding of the
links between resveratrol intake and health.
Altres capítols de llibre
323
Capítol de llibre V: Montserrat Rabassa, María del Pilar Trespalacios, Mireia UrpiSardà, Rafael Llorach, Sara Tulipani, Raul Zamora-Ros, Mar Garcia-Aloy, Cristina
Andrés-Lacueva. Polifenoles como antioxidantes. A: González-Aguilar GA, Ayala
Zavala JF, Álvarez-Parrilla E, de la Rosa L (editors): Antioxidantes en alimentos y salud.
Clave Editorial; 2012. ISBN: 978-607-437-207-6.
Comunicacions a Congressos
Durant el període predoctoral s’han presentat fins a 17 comunicacions a congressos, 2
dels quals presenten alguns dels resultats recollits en la present Tesi Doctoral. Aquestes
2 comunicacions s’han presentat com a pòster i com a comunicació pòster en dos
congressos internacionals: el “IX Congreso Internacional de Barcelona sobre la Dieta
Mediterránea: un estilo de vida saludable para prevenir la obesidad”, celebrat a Barcelona,
i al “World Forum for Nutrition Research Conference: Mediterranean Food on Health
and Disease”, celebrat a Reus. Més endavant, s’exposen la resta de comunicacions
presentades en diferents congressos internacionals.
Comunicacions a congressos
327
Pòster: Tulipani S, Llorach R, Jáuregui O, López-Uriarte P, Garcia-Aloy M, Bulló M,
Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. A nutrimetabolomic strategy driven by LC-ESI-qToF-MS and LC-ESI-ITD-FTMS to evaluate the effect of nuts intake in humans with
diagnosed metabolic syndrome. IX Congreso Internacional de Barcelona sobre la Dieta
Mediterránea: un estilo de vida saludable para prevenir la obesidad. Barcelona
(Espanya); Març 2012.
Comunicacions a congressos
329
Comunicació pòster: Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Salas-Salvadó
J, Martínez-González MA, Corella D, Covas MI, Estruch R, Serra-Majem Ll, AndresLacueva C. Novel biomarkers of bread intake in cardiovascular high-risk participants by
a mass spectrometry-based metabolomics approach. World Forum for Nutrition Research
Conference: Mediterranean Food on Health and Disease. Reus (Espanya), Maig 2013.
Comunicacions a congressos
331
Conferència convidada: Andrés-Lacueva C, Urpi-Sarda M, Llorach R, Rotchés-Ribalta
M, Chiva-Blanch G, Zamora-Ros R, Boto-Ordóñez M, Vázquez R, Rabassa-Bonet M,
Tulipani S, Trespalacios P, Garcia-Aloy M, Lamuela-Raventos RM, Estruch R.
Metabolomic and targeted study of biomarkers in an interventional clinical study on wine
consumption. International Conference Wine Active Compounds. Beaune (França); Març
2011.
Comunicació oral: Tulipani S, Llorach R, Jáuregui O, López-Uriarte P, Garcia-Aloy M,
Bulló M, Salas-Salvadó J, Andres-Lacueva C. HPLC-ESI-q-ToF-MS and LC-ESI-LTQOrbitrap-MS driven untargeted strategy to explore changes in the urinary metabolome of
MetS subjects following nuts consumption. International Workshop on Metabolomics
‘Technology and Applications’. Bilbao (Espanya); Setembre 2011.
Conferència convidada: Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Jauregui O, Garcia-Aloy
M, Vazquez R, Rabassa M, Fernandez F, Perera A, Andres-Lacueva C. Polyphenols-rich
diets consumption and cardiovascular-health promoting: application of different
nutrimetabolomics strategies to develop new biomarkers of intake and health-effects. 5th
International Conference on Polyphenols and Health. Sitges, Barcelona (Espanya);
Octubre 2011.
Comunicació oral: Tulipani S, Llorach R, Jáuregui O, López-Uriarte P, Garcia-Aloy M,
Bulló M, Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. Metabolomics unveils urinary changes in
subjects with metabolic syndrome following 12-week nuts consumption. 5th International
Conference on Polyphenols and Health. Sitges, Barcelona (Espanya); Octubre 2011.
Pòster: Tulipani S, Urpi-Sarda M, García-Villaba R, Rabassa M, López-Uriarte P,
Garcia-Aloy M, Bulló M, Tomás-Barberán F, Salas-Salvadó J, Espín JC, Andrés-Lacueva
C. Urolithins are the main urinary microbial-derived phenolic metabolites able to
discriminate a moderate consumption of nuts in subjects with MetS. 5th International
Conference on Polyphenols and Health. Sitges, Barcelona (Espanya); Octubre 2011.
Conferència convidada: Tulipani S, Llorach R, Perera-Luna A, Jáuregui O, LópezUriarte P, Garcia-Aloy M, Bulló M, Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. Discovery of
metabolomics biomarkers of nuts consumption to decipher the role in the improvement
of the metabolic syndrome status. 8th Annual International Meeting of the Metabolomics
Society. Washington (Estats Units d’Amèrica); Juny 2012.
332
Annex
Pòster: Tulipani S, Llorach R, Perera-Luna A, Jáuregui O, López-Uriarte P, Garcia-Aloy
M, Bulló M, Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. Metabolomic biomarkers of type 2
diabetes in the identification of responsive metabotypes to nuts consumption in the
reduction of insulin resistance. 72nd Scientific sessions of the ADA (American Diabetes
Association). Philadelphia (Estats Units d’Amèrica); Juny 2012.
Pòster: Tulipani S, Llorach R, Perera-Luna A, Jáuregui O, López-Uriarte P, Garcia-Aloy
M, Bulló M, Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. Metabolomic biomarkers of type 2
diabetes in the identification of responsive metabotypes to nuts consumption in the
reduction of insulin resistance. 26th International Conference on Polyphenols (ICP 2012).
Florence (Itàlia); Juliol 2012.
Pòster: Tulipani S, Llorach R, Perera-Luna A, Fernandez-Albert F, López-Uriarte P,
Garcia-Aloy M, Bulló M, Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. Metabolomics to explore
the metabolic syndrome status and response to nuts consumption. NuGOweek 2012:
“Nutrition, lifestyle and genes in the changing environment”. Helsinki (Finlàndia); Agost
2012.
Comunicació oral: Tulipani S, Llorach R, Perera-Luna A, Jáuregui O, López-Uriarte P,
Garcia-Aloy M, Bulló M, Salas-Salvadó J, Andrés-Lacueva C. Metabolomic biomarkers
of type 2 diabetes in the identification of responsive metabotypes to nuts consumption in
the reduction of insulin resistance. II International Workshop on Metabolomics &
Proteomics (CIC BioGUNE). Bilbao (Espanya); Octubre 2012.
Pòster: Garcia-Aloy M, Llorach R, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Vázquez Fresno R,
Rabassa-Bonet M, Andres-Lacueva C. Nutrimetabolomic approach to identify
biomarkers for bread consumption monitoring in an elderly mediterranean population at
high cardiovascular risk. Second International Congress of Translational Research in
Human Nutrition. Clermont-Ferrand (França); Març 2013.
Comunicació oral: Andres-Lacueva C, Garcia-Aloy M, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Salas-
Salvado J, Martinez-Gonzalez MA, Corella D, Covas MI, Estruch R, Serra-Majem Ll,
Llorach R. Discovery biomarkers of bread intake in cardiovascular high-risk participants.
A Mass Spectrometry-based Metabolomics approach. 9th Annual International
Conference of the Metabolomics Society. Glasgow (Regne Unit); Juliol 2013.
Comunicacions a congressos
333
Conferència convidada: Andres-Lacueva C, Urpi-Sarda M, Garcia-Aloy M, VazquezFresno R, Estruch R, Corella D, Martínez-González MA, Salas-Salvadó J, Covas MI,
Serra-Majem L, Draper J, Llorach R. New metabolomics strategies in clinical nutrition
research: from diet to revealing disease risk biomarkers. 20th International Congress of
Nutrition. Granada (Espanya); Setembre 2013.
Pòster: Garcia-Aloy M, Llorach R, Vázquez-Fresno R, Urpi-Sarda M, Tulipani S, Salas-
Salvadó J, Martínez-González MA, Corella D, Covas MI, Estruch R, Andres-Lacueva C.
Untargeted metabolomic fingerprinting of the Mediterranean dietary pattern. NuGOweek
2013: “Nutrigenomics & More”. Freising-Weihenstephan, Munich (Alemanya);
Setembre 2013.
Conferència convidada: Andres-Lacueva C, Urpi-Sarda, Garcia-Aloy M, VazquezFresno R, Estruch R, Corella D, Martínez-González MA, Salas-Salvadó J, Covas MI,
Serra-Majem L, Draper J, Llorach R. New metabolomics strategies in clinical nutrition
research: from diet to revealing disease risk biomarkers. VI International Confrence on
Polyphenols and Health (ICPH-6). Buenos Aires (Argentina); Octubre 2013.
Fly UP