...

UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI

by user

on
Category: Documents
1

views

Report

Comments

Transcript

UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ÍNDEX
ÍNDEX DE FIGURES .............................................................................................................. 5
ÍNDEX DE TAULES................................................................................................................ 6
ÍNDEX D’ABREVIATURES. ................................................................................................ 7
1.
INTRODUCCIÓ ................................................................................... 10
1.1.
PATOGÈNIA DE LA DIABETIS MELLITUS TIPUS 2......................................... 12
1.1.1. SECRECIÓ D’INSULINA I RESISTÈNCIA A LA INSULINA A LA DM2............ 12
1.1.1.1. Secreció d’insulina a la DM2............................................................................... 12
1.1.1.2. Resistència a la insulina a la DM2. ...................................................................... 13
1.1.2. HIPÒTESI SOBRE EL FENOTIP I EL GENOTIP ESTALVIADOR (THRIFTY
PHENOTYPE AND GENOTYPE) ............................................................................. 15
1.2.
MECANISMES CEL·LULARS DE RESISTÈNCIA A LA INSULINA ................ 17
1.2.1. ACCIÓ DE LA INSULINA A NIVELL CEL·LULAR .............................................. 17
1.2.2. PROTEÏNES AMB ALTERACIONS GENÈTIQUES ASSOCIADES A
RESISTÈNCIA A LA INSULINA.............................................................................. 19
1.2.2.1. Receptor d’insulina .............................................................................................. 20
1.2.2.2. Substrats del receptor de la insulina (IRS) ........................................................... 20
1.2.2.3. Subunitat de la PI3-K p85 ................................................................................. 20
1.2.2.4. Transportadors de glucosa.................................................................................... 21
1.2.2.5. La glicogen sintasa............................................................................................... 21
1.2.3. MECANISMES CEL·LULARS ASSOCIATS A RESISTÈNCIA A LA
INSULINA .................................................................................................................. 22
1.2.3.1. La hiperglucèmia.................................................................................................. 22
1.2.3.2. El PPAR ............................................................................................................. 22
1.2.3.3. Les adipoquines.................................................................................................... 23
1.3.
EL FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA ..................................................... 28
1.3.1. BIOSÍNTESI I ESTRUCTURA PROTEICA DEL TNF.......................................... 28
1.3.2. ESTRUCTURA DEL GEN DEL TNF ..................................................................... 30
1.3.3. RECEPTORS DE TNF ............................................................................................. 30
1
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.3.4. ELS GENS DEL TNFR1 I TNFR2 ............................................................................. 32
1.3.5. ACCIONS DEL TNF SOBRE EL METABOLISME. ESTUDIS “IN VIVO” I
“IN VITRO” SOBRE ANIMALS D’EXPERIMENTACIÓ ....................................... 34
1.3.5.1. Accions del TNF sobre el metabolisme lipídic.................................................. 34
1.3.5.2. Accions del TNF sobre el metabolisme de la glucosa i acció de la insulina ..... 35
1.3.5.3. Estudis genètics amb models de rates “knock-out” ............................................. 37
1.3.6. EL TNF COM A MEDIADOR DE RESISTÈNCIA A LA INSULINA ALS
HUMANS .................................................................................................................... 41
1.3.6.1. Expressió del TNF en teixit adipós i muscular humà i resistència a la
insulina ................................................................................................................. 42
1.3.6.2. Variacions en el gen del TNF humà i resistència a la insulina .......................... 43
1.3.6.3. Els receptors R1 i R2 del TNF i resistència a la insulina .................................. 43
1.4.
LA INTERLEUCINA-6............................................................................................... 45
1.4.1. SÍNTESI I ESTRUCTURA PROTEICA..................................................................... 45
1.4.2. ESTRUCTURA DEL GEN DE LA IL-6..................................................................... 45
1.4.3. RECEPTOR DEL LA IL-6. ESTRUCTURA I TRANSDUCCIÓ DEL SENYAL..... 46
1.4.3.1. Estructura del receptor de la IL-6 i del gp130...................................................... 46
1.4.3.2. Mecanisme de transducció del senyal per mitjà de gp130 ................................... 47
1.4.4. ACCIONS DE LA IL-6 SOBRE EL METABOLISME. ESTUDIS “IN VIVO” I
“IN VITRO” SOBRE ANIMALS D’EXPERIMENTACIÓ. ...................................... 48
1.4.4.1. Paper de la IL-6 sobre el metabolisme en humans............................................... 48
1.4.4.2. Estudis genètics de la IL-6 en humans. ................................................................ 49
2.
OBJECTIUS ........................................................................................ 50
3.
MATERIALS I MÈTODES ................................................................... 53
3.1.
SUBJECTES MOTIU D’ESTUDI.............................................................................. 55
3.1.1. ESTUDI 1. ................................................................................................................... 55
3.1.2. ESTUDI 2. ................................................................................................................... 56
3.1.3. ESTUDI 3. ................................................................................................................... 57
3.1.4. ESTUDI 4. ................................................................................................................... 57
3.2.
RECOLLIDA DE DADES ENTRE TOTS ELS ESTUDIS..................................... 58
3.3.
DESCRIPCIÓ DE LA METODOLOGIA ................................................................. 60
2
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.3.1. PARÀMETRES CLÍNICS .......................................................................................... 60
3.3.1.1. Índex de Massa Corporal (BMI) .......................................................................... 60
3.3.1.2. Grau d’Obesitat .................................................................................................... 60
3.3.1.3. Determinació de la Tensió Arterial ...................................................................... 60
3.3.2. PARÀMETRES ANTROPOMÈTRICS. AVALUACIÓ DE LA COMPOSICIÓ
CORPORAL ................................................................................................................ 61
3.3.2.1. Mesures Antropomètriques .................................................................................. 61
3.3.2.2. Impedància Bioelèctrica....................................................................................... 64
3.3.3. PARÀMETRES METABÒLICS ................................................................................ 64
3.3.3.1. Determinació de la Resistència a la Insulina........................................................ 65
3.3.3.2. Determinació de Glucosa. .................................................................................... 66
3.3.3.3. Determinació d’Insulina....................................................................................... 66
3.3.3.4. Determinació del Colesterol Total. ...................................................................... 67
3.3.3.5. Determinació de les Lipoproteïnes VLDLc, LDL-c i HDLc. .............................. 67
3.3.3.6. Determinació de Triglicèrids i VLDL – Triglicèrids. .......................................... 68
3.3.3.7. Determinació d’Àcids Grassos Lliures. ............................................................... 68
3.3.3.8. Determinació de Nivells de HbA1c ..................................................................... 68
3.3.3.9. Determinació de les Fraccions Solubles dels Receptors 1 i 2 del TNF i
dels Nivells de IL-6.............................................................................................. 68
3.3.3.10. Determinació de Leptina. ..................................................................................... 69
3.3.3.11. Determinació de Globulina Transportadora de Cortisol (CBG) i la Globulina
Glicosidada........................................................................................................... 70
3.3.3.12. Fórmula Leucocitària i Recompte de Cèl.lules Blanques. ................................... 70
3.3.4. PARÀMETRES GENÈTICS....................................................................................... 70
3.3.4.1. Extracció de l’Àcid Desoxirribonucèid (DNA) ................................................... 70
3.3.4.2. Anàlisi de la Regió 3’ no Traduïda del Gen del TNFR2...................................... 71
3.3.4.3. Anàlisi del Polimorfisme Genètic –174 del Gen de la IL-6. ............................... 75
3.4.
TRACTAMENT ESTADÍSTIC DE LES DADES. ................................................... 78
4.
PUBLICACIONS ................................................................................. 80
5.
DISCUSSIÓ ....................................................................................... 109
5.1.
ESTUDI 1.................................................................................................................... 110
5.2.
ESTUDI 2.................................................................................................................... 114
3
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
5.3.
ESTUDI 3.................................................................................................................... 119
5.4.
ESTUDI 4.................................................................................................................... 123
6.
CONCLUSIONS ................................................................................ 126
7.
BIBLIOGRAFIA................................................................................. 129
4
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ÍNDEX DE FIGURES
Figura 1. Esquema de la transmissió dels senyals del receptor de la insulina................ 18
Figura 2. Esquema de l’estructura de l’homotrímer del TNF..................................... 29
Figura 3. Esquema de l’estructura del gen del TNF................................................... 30
Figura 4. Esquema de la família dels receptors de TNF............................................... 31
Figura 5. Esquema de l’estructura del gen-proteïna del TNFR2.................................. 33
Figura 6. Esquema de l’estructura del gen de la IL-6................................................... 46
Figura 7. Esquema de l’estructura del receptor de la IL-6 i el gp130........................... 47
Figura 8. Esquema de la transmissió dels senyals de la IL-6....................................... 48
Figura 9. Fotografia del patró de bandes corresponent a les variants A1, A2 i A3...... 74
Figura 10. Fotografia del polimorfisme – 174G>C del gen de la IL-6......................... 77
5
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ÍNDEX DE TAULES
Taula 1. Transportadors cel·lulars de glucosa................................................................ 19
Taula 2. Mecanismes d’acció del TNF sobre el metabolisme lipídic i de la glucosa.. 37
Taula 3. Estudis “Knock-out” per al gen del TNF i per als seus receptors................. 40
Taula 4. Variants genètiques de la regió 3’UTR del gen del TNFR2............................ 75
6
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ÍNDEX D’ABREVIATURES
Acrp30: Adipocyte Complement Related Protein of 30kDa
AGL: Àcids grassos lliures
Akt: Proteïna Ser/Thr quinasa B
AMP: Adenosine Monophosphate
AP1/AP2: Activador de proteïna d’unió un /dos
ATP: Adenosine Triphosphate
A260 : Absorbància a dos-cents seixanta nanòmetres
Bis, bisacrilamida: N,N’- metile- bisacrilamida
BMI: Body Mass Index
bp: base pair
CBG: Cortisol Binding Globulin
C/EBP: CCAAT/ Enhancer Binding Proteins beta
db: Gen del receptor de la leptina
DM: Diabetis mellitus
DM2: Diabetis mellitus tipus dos
dNTPs: Deoxynucleoside (5’-) Triphosphate
DNA: Deoxyribonucleic Acid
EASIA: Enzyme Amplified Sensitivity Immunoassay
fa/fa: presència d’obesitat i diabetes
FSIVGTT: Frequently Sampled Intravenous Glucose Tolerance Test
GAS: g- interferon Activaction Sites
GLUT-1/-4: Glucose Transporter-1/-4
Gp130: glycoprotein 130
GSK-3: glicogen sintetasa quinasa tres
HbA1c: Hemoglobin A1c
HLA: Human Leukocyte-associated Antigen
IFN-: Interferon-gamma
Ig: Immunoglobulin
IL-6: Interleucina sis
7
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
IL-1: Interleucina un
IRF-1: Interferon Regulatory Factor 1
IRMA: Immunoradiometric Assay
IRS: Insulin Receptor Substrate
JAK-kinase: Janus Kinase
Kb: Kilobases
kDa: Kilodaltons
LPL: Lipoprotein Lipase
LPS: Lipopolysaccharide
LT-: Lymphotoxin alpha
LT-: Lymphotoxin beta
M: Molar
MAP: Mitogen-Activated Protein
MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase
mRNA: Messenger Ribonucleic Acid
NF-AT: Nuclear Factor of Activated T cells
NF-IL-6: Nuclear Factor of IL-6
NF-kB: Nuclear Factor- Kappa beta
ob: Gen de la leptina
OGTT: Oral Glucose Tolerance Test
P: Fosfat
PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PCR: Polimerase Chain Reaction
PI3-K: Phosphatidylinositol 3 quinase
PKC: Protein Quinase C
PPAR: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma
RAF: Ser/Thr proteina quinasa
RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphism
RI: Resistència a la Insulina
RIA: Radioimmunoassay
Ser: Serina.
8
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
ÍNDEX
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
SG: Eficàcia de la glucosa
SHC: Src Homology Collagen Protein
SI: Índex de sensibilitat a la insulina
SNS: Sympathetic Nervous System
SP-1: Specificity Protein 1
SSCP: Single Strand Conformation Polymorphisms
STAT3: Signal Transducers and Activators of Transcription 3
sTNFRs: Fraccions solubles dels receptors del factor de necrosi tumoral
sTNFR1/sTNFR2: Soluble Tumor Necrosis Factor Receptor 1/2
TACE: TNF-a Converting Enzime
Taq: Thermus aquaticus
TBE: Tris/Borate Electroforesis
TEMED: N,N,N’,N’- tetrametilendiamina
Thr: Treonina.
TNF-: Tumor Necrosis Factor alfa
TNF-: Tumor Necrosis Factor beta
TNFR1/TNFR2: Tumor Necrosis Factor Receptor 1/2
TRAF: TNF Receptor-Associated Factor 2
Tyr: Tirosina.
TZD: Tiazolidinedione
WHR: Waist-Hip Ratio
3’UTR: Untranslated Region
9
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1. INTRODUCCIÓ
10
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
La diabetis mellitus (DM) és un grup de malalties metabòliques caracteritzades per
hiperglucèmia deguda a defectes en la secreció d’insulina, l’acció de la insulina o
ambdues. La majoria dels casos de diabetis pertanyen a dues categories etiopatogèniques.
La DM tipus 1 és deguda a un dèficit d’insulina a causa d’una pèrdua de massa cel·lular 
per un procés autoimmunològic sobre l’illot pancreàtic. L’altra categoria, la DM tipus 2,
molt més prevalent, és fruit de la combinació d’una resistència a la insulina i d’una
inadequada resposta compensatòria de secreció d’insulina pel pàncrees.
La diabetis mellitus tipus 2 (DM2) representa entre el 70 i el 85% del total de
diabetis en la majoria dels països amb un 6% de prevalença en el món occidental. Apareix
més freqüentment en adults (> 30 anys) i la incidència augmenta amb l’edat. És una de les
malalties no declarades més importants per la seva altíssima prevalença i pels importants
costos socials que representen les seves substancials morbiditat i mortalitat, freqüentment
per complicacions associades, tant de tipus agut (coma hiperglucèmic i hiperosmolar,
hipoglucèmies) com cròniques.
Les complicacions cròniques es presenten en forma de microangiopatia (sobretot
als sistemes renal i ocular i als nervis perifèrics) i de macroangiopatia. Aquesta darrera es
caracteritzada pel desenvolupament accelerat d’aterosclerosi sobretot a vasos coronaris
d’extremitats inferiors i cerebrals. Els principals factors involucrats són la dislipèmia, la
hiperinsulinèmia i la hiperglucèmia. Aquestes darreres complicacions són les més
freqüents i les que s’associen a un increment d’incidència de malaltia coronària, malaltia
vascular perifèrica i malaltia cerebrovascular. La lesió macrovascular és la que s’associa a
major morbimortalitat total.
Típicament la DM2 roman lliure de símptomes durant un temps, fins i tot anys,
amb una progressiva i subtil aparició de la simptomatologia. El diagnòstic moltes vegades
esdevé principalment per una troballa accidental, per la presentació de polidípsia o
poliúria, per infeccions recurrents o per complicacions pròpies de la DM2. Això fa que, en
una gran proporció, aquests pacients restin per diagnosticar. D’altra banda, els darrers
estudis mostren un clar increment de pacients amb DM2. És probable que la proporció de
pacients no diagnosticats disminueixi en un futur, quan s’identifiquin processos patogènics
i defectes genètics específics que permetin una millor comprensió de la malaltia i una
detecció més precoç.
11
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.1. PATOGÈNIA DE LA DIABETIS MELLITUS TIPUS 2
1.1.1. SECRECIÓ D’INSULINA I RESISTÈNCIA A LA INSULINA A LA DM2
1.1.1.1. Secreció d’insulina a la DM2
Sobre la base d’una gran quantitat d’estudis, sembla clar que el desenvolupament
de la diabetis mellitus tipus 2 es dóna quan la resistència a l’acció de la insulina en els
teixits no pot ser compensada per la secreció d’insulina per la cèl·lula  pancreàtica
(Ferrannini E, 1998). Així, els individus amb només resistència a la insulina poden
romandre tolerants a la glucosa o amb tolerància disminuïda durant anys sense arribar a
desenvolupar DM2.
No obstant això, hi ha dades que demostren una disminució de la massa cel·lular 
pancreàtica amb la consegüent disminució de la capacitat de secreció d’insulina en els
pacients amb DM2. Aquesta disminució de massa cel·lular ha estat en part relacionada amb
dipòsits de substància amiloide, concretament d’un pèptid secretat per la mateixa cèl·lula
, l’amilina (Zawalich WS, 1995). A part de la disminució de la massa cel·lular total, també
s’han observat alteracions en el ritme de secreció de la insulina, així com increments en la
proporció de proinsulina en relació amb la insulina (O’Rahilly S, 1988) i (Kahn SE, 1995).
Finalment, altres dades que confirmen la hipòtesi de l’existència d’un defecte
secretor de la cèl·lula  pancreàtica per desenvolupar una diabetis davant una resistència a
la insulina ens les aporten els clàssics treballs amb dexametasona, en què la resistència a la
insulina induïda per aquest fàrmac és compensada en individus sans, però no en pacients
amb DM2 (LaCava EC, 1985).
La manca d’adaptació de la cèl·lula beta pot contribuir a la hiperglucèmia i
s’observa freqüentment amb l’augment de l’edat, la inactivitat física i amb l’excés de pes.
S’ha suggerit també l’existència d’una predisposició genètica ja existent en els individus
prediabètics.
12
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.1.1.2. Resistència a la insulina a la DM2.
La resistència a la insulina (RI) es defineix com la inhibició de l’acció de la insulina
sobre el transport de glucosa des de l’espai extracel·lular (sang o fluid intersticial) a les
cèl·lules dels teixits insulino sensibles, principalment el fetge, el muscle esquelètic i el
teixit adipós.
El factor fonamental que s’observa en les fases inicials de la DM2 és una
hiperglucèmia postprandrial que depèn bàsicament de la resistència muscular a l’acció de
la insulina. Més tard els pacients desenvolupen una progressiva hiperglucèmia en dejú, la
qual podria ser, en part, explicada per un augment de producció glucosa hepàtica deguda a
la resistència a la insulina en el fetge.
Les causes de resistència a la insulina poden classificar-se en hereditàries o
adquirides.
a) Causes hereditàries per al desenvolupament de la RI .
S’han descrit diverses mutacions en gens relacionades amb l’acció de la insulina.
Aquestes variacions genètiques puntuals expliquen només una fracció petita (un 5%) de
totes les possibles causes de resistència a la insulina, i, per tant, probablement resten per
identificar la majoria dels gens implicats en la predisposició d’aquest desordre.
No hi ha dubte, però, que en el desenvolupamentt de la DM2 existeix una forta
predisposició genètica. D’una banda, diversos estudis demostren una incidència de la
malaltia variable entre els grups ètnics de poblacions humanes. D’una altra banda una
evidència clara de la importància del factor genètic prové dels estudis amb bessons
homozigots, que mostren una concordança per la DM2 del 90% (Barnett A, 1981). Ara bé,
el tipus d’herència continua sense ser coneguda.
El fet que la DM2 és típicament una malaltia d’edat avançada fa pensar que a part
del factor genètic que predisposa a la RI, és possible que intervinguin factors ambientals o
adquirits per al desenvolupamentt final del fenotip. Tot seguit descriurem breument alguns
d’aquests factors.
13
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
b) Causes adquirides per al desenvolupament de la DM2.
Les condicions adquirides més associades a resistència a la insulina o més
comunament associades a desenvolupament de DM2 són l’edat, la gestació, la inactivitat
física i l’obesitat.
L’edat: és àmpliament conegut que la RI augmenta amb l’edat (DeFronzo RA,
1979), segurament per diferents causes, però la més evident és per la seva
associació amb canvis en la composició corporal. L’edat comporta una pèrdua de
massa muscular i un augment de massa grassa (Borkan GA, 1983), aquesta darrera
associada a RI.
La gestació: durant el tercer trimestre de gestació, es desenvolupa una
resistència a la insulina. Moltes gestants, però, romanen tolerants a la glucosa per
compensació amb una sobresecreció d’insulina. Altres, que no poden compensar
aquesta RI acaben desenvolupant una diabetis gestacional que després del part pot
manifestar-se com una veritable DM2 (Kjos SL, 1995). Les raons del
desenvolupament de la diabetis gestacional no són del tot conegudes.
L’activitat física: l’augment de l’activitat física va acompanyada generalment
de millores en la sensibilitat perifèrica a la insulina per un mecanisme no del tot
comprès. Alguns autors atribueixen aquest fet a un augment del transportador de
glucosa-4 en el múscul esquelètic (Houmard JA, 1991).
L’obesitat: la DM2 s’associa fortament amb l’obesitat. Aproximadament un
80% dels pacients amb DM2 són obesos. El fet que la RI augmenti amb el guany de
pes
i disminueixi amb la pèrdua de pes (Sims EAH, 1973) fa pensar que
l’acumulació de massa grassa pot ser una causa de RI. De fet, molts investigadors
suggereixen que la RI en la majoria dels pacients amb DM2 és el resultat d’un
increment de l’adipositat visceral (obesitat central) (Lemiuez S, 1996). Aquesta
14
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
adipositat, a diferència de la subcutània o de l’obesitat total, es correlaciona de
forma independent amb la RI (Kissebah AH 1994).
En els darrers anys, a redós d’importants estudis en fisiopatologia de l’obesitat, s’ha
descobert el paper actiu del teixit adipós quant a la secreció de substàncies que prenen part
activa en l’homeòstasi de la glucosa. Entre aquestes substàncies destaquen: els àcids
grassos lliures, la leptina, l’adiponectina, la resistina i les citocines, com el factor de
necrosi tumoral alfa (TNF) i la interleucina 6 (IL-6). Aquestes molècules han demostrat
un paper regulador de l’acció de la insulina en els teixits diana i sobre la secreció
d’insulina en el pàncrees. S’ha suposat que una expansió del teixit adipós, especialment de
la regió abdominal, pot donar lloc a un augment d’alliberació d’aquests productes, que
mitjançant una acció endocrina induirien a RI en altres teixits (múscul esquelètic i fetge) i,
fins i tot, alteracions de la secreció de la cèl·lula pancreàtica (Hotamisligil GS, 1994 i
Boden G, 1997).
1.1.2. HIPÒTESI SOBRE EL FENOTIP I EL GENOTIP ESTALVIADOR
(THRIFTY PHENOTYPE AND GENOTYPE)
El concepte del genotip estalviador ajuda a aportar una explicació sobre el
desenvolupament de la DM2 i la prevalença actual des d’un punt de vista evolutiu. El
primer en definir aquest concepte va ser Neel (Neel JV, 1962). L’autor proposa que en
èpoques de fam, períodes als quals l’home primitiu estava sovint exposat, el “genotip
diabètic” (format per combinació de gens diferents) permetria de forma més eficient la
utilització dels recursos nutritius per l’organisme, i facilitaria l’emmagatzematge de
calories en forma de greix.
Els gens estalviadors que formen aquest genotip, haurien tingut un efecte selectiu
en l’evolució, ja que els individus que el tinguessin, en períodes de mancança, presentarien
un índex de supervivència més elevat i haurien tendit a augmentar el seu nombre de
descendents respecte d’aquells que no el tinguessin. Avui en dia, en canvi, amb una
contínua abundància de calories, aquests gens tendirien a predisposar a l’obesitat i la
diabetis. La forta associació entre aquestes dues patologies dóna suport a aquesta hipòtesi.
15
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Els estudis a favor del genotip estalviador es donen en rosegadors, en els quals es
demostra que els animals amb diabetis i obesitat presenten una capacitat per sobreviure a la
manca d’aliments millor que els controls sans (Coleman DL, 1979).
D’altra banda, estudis recents han demostrat una relació entre certs marcadors
d’activitat inflamatòria com el TNF-alfa, la IL-6, la proteïna C reactiva i la RI (PicKup JC,
1997). S’ha suposat que aquesta relació té el seu origen en una adaptació filogenètica dels
nostres avantpassats davant les agressions a les quals sovint estaven exposats. En aquestes
condicions, l’activitat inflamatòria preponderant devia suposar una clara adaptació, al
contrari que en l’actualitat (Fernandez-Real JM, 1999).
16
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.2. MECANISMES CEL·LULARS DE RESISTÈNCIA A LA
INSULINA
Els mecanismes que es descriuràn intenten explicar a nivell molecular els estats de
resistència a la insulina, especialment a l’obesitat i a la diabetis tipus 2. Durant dècades, la
investigació sobre la resistència a la insulina s’ha centrat en identificar en els teixits diana
les molècules que intervenen en la transducció del senyal d’aquesta hormona. Abans de
descriure les molècules que s’hi han vist implicades, per situar-les a nivell cel·lular
repassarem molt breument la transducció del senyal de la insulina i algunes de les proteïnes
que hi intervenen.
1.2.1. ACCIÓ DE LA INSULINA A NIVELL CEL·LULAR
La insulina és una hormona amb potents efectes essencials per a l’homeòstasi
normal de la glucosa i per al metabolisme lipídic i de proteïnes. Actua com a hormona
anticatabòlica, ja que inhibeix la gluconeogènesi, la glucogenòlisi, la lipòlisi i la proteòlisi,
i com a hormona anabòlica, ja que activa sistemes de transport i enzims relacionats amb la
utilització i l’emmagatzematge d’aminoàcids, àcids grassos i glucosa. Els teixits més
importants per la seva acció són el fetge, el múscul i el teixit adipós.
La insulina inicia l’acció en unir-se al seu receptor de membrana, expressat tant en
els teixits diana clàssics per la insulina com en els no clàssics (cèl·lules de la sang, intestí,
cervell, cèl·lules gonadals, etc.). El receptor és una proteïna transmembrana tirosina (Tyr)quinasa, amb dues subunitats  i dues  que formen una estructura heterotetràmera 2 2
(Ullrich A, 1985), (Ebina Y, 1985). La unió de la insulina a zones específiques de la
subunitat  permet un ràpid canvi de conformació en el receptor que posa en marxa
l’activitat tirosina-quinasa de la subunitat . Aquesta activitat es tradueix en una
autofosforilació del receptor de tres residus Tyr. Finalment, l’autofosforilació del receptor
provoca un canvi de conformació que permet a molècules d’adenosin trifosfat (ATP)
arribar al lloc catalític i als substrats que puguin ser fosforilats en residus Tyr (Hubbard
SR, 1994 i Hubbard SR, 1997).
17
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
El receptor també és regulat negativament per una fosforilació en residus Serina/Treonina
(Ser/Thr) per mitjà de quinases i de la pròpia insulina.
Els senyals del receptor es tradueixen per cascades de proteïnes fosforilades
mitjançant dues vies principals: una, mitjançant la proteïna quinasa “mitogen activated
protein quinasa” (MAP) que intervé en els efectes de creixement de la insulina, i l’altra,
per la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-K) per on es duen a terme els efectes sobre el
metabolisme.
Les proteïnes que hi intervenen poden ser agrupades en tres nivells. En el primer
nivell hi intervenen molècules que s’uneixen directament al receptor, com els substrats de
receptor d’insulina (IRS-1, 2, 3 i 4), i la Src i proteïna homòloga al col·lagen (SHC). El
segon nivell el representen intermediaris com les proteïnes RAF, la PI3-K i la proteïna
Ser/Thr quinasa B (Akt). Les molècules que formen aquests dos nivells anteriors actuen
sobre la membrana plasmàtica o en el citosol cel·lular. El tercer nivell el formen proteïnes
quinases com la MAP quinasa (MAPK), la proteïna quinasa C (PKC), i el glicogen
sintetasa 3 (GSK-3), que son translocades al nucli. Allí actuen com a reguladores de la
transcripció de determinats gens (Albert KGMM, 1997) (figura 1).
Figura 1. Esquema de la transmissió dels senyals del receptor de la insulina
RECEPTOR
INSULINA
PROTEÏNES
SHC
PROTEÏNES
IRS
NIVELL 1
RAF
PI3-K
NIVELL 2
AkT
MAPK
Expressió de gens /
Mitogènesi
P70
Síntesi
proteïnes
Tor Gsk3 aPKCs
PDE
BAD
NIVELL 3
Síntesi Transport Anti- Antiglicogen glucosa lipòlisi apoptosi
18
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
La glucosa és transportada a l’interior de la cèl·lula mitjançant cinc transportadors
de membrana amb propietats cinètiques i distribucions cel·lulars diferents (Shepherd PR,
1999). L’únic transportador que depèn d’insulina és el Glut-4, expressat en múscul i teixit
adipós (taula 1).
Taula 1. Transportadors cel·lulars de glucosa
TRANSPORTADORS DE GLUCOSA
Transportador
Localització
Classificació
GLUT-1
Cèl·lules vermelles, cervell Glucosa dependent
GLUT-2
Fetge, cèl·lules B
Glucosa dependent
GLUT-3
Neurones
Sodi dependent
GLUT-4
Múscul, teixit adipós
Insulina depenent
Intestí prim, cervell,
Transportador fructosa,
múscul
afinitat baixa per glucosa
GLUT-5
Tot seguit citarem diverses molècules amb alteracions genètiques que s’han
associat a resistència a la insulina i descriurem alguns mecanismes moleculars que s’han
relacionat com a possibles mediadors d’aquest desordre.
1.2.2. PROTEÏNES AMB ALTERACIONS GENÈTIQUES ASSOCIADES A
RESISTÈNCIA A LA INSULINA
En algunes d’aquestes molècules s’han descrit mutacions en el gen corresponent que
afecten tant la funció de la proteïna com l’expressió del gen. En altres casos només s’han
descrit una expressió o funció anòmala de la proteïna sense identificar-se el defecte
genètic. Finalment, en algunes molècules s’han descrit associacions entre algun
polimorfisme genètic i la RI. En cap cas, però, s’ha demostrat que aquestes anomalies
descrites juguin per si soles un paper dominant per al desenvolupamentt de la RI en la
DM2 i en l’obesitat (Krook A, 1996), (Freidenberg GR, 1988).
19
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.2.2.1. Receptor d’insulina
Mutacions: (Kadowaki T, 1988) s’han descrit més de cent mutacions capaces
d’afectar de formes diverses el receptor, entre les quals destaquem:
1- Disminució en la síntesi d’una de les seves subunitats.
2 - Alteracions en el transport del receptor a la membrana.
3 - Alteracions en l’acoblament de la insulina al receptor.
4 - Degradació accelerada del receptor.
5 - Disminució del l’activitat tirosina-quinasa.
Expressió genètica i funció proteica: Alguns autors han observat que tant els nivells
d’expressió del gen del receptor com la seva activitat tirosina-quinasa es troben disminuïts
en el teixit adipós i en el múscul esquelètic d’individus amb obesitat, i també en aquest
darrer teixit i en el fetge d’individus amb DM2 (Caro JF, 1987). La pèrdua de pes dels
individus obesos millora l’expressió del gen junt amb la recuperació de la sensibilitat a la
insulina. En la DM2, però, la recuperació de la sensibilitat a la insulina no és completa, fet
que suggereix l’existència d’un defecte postreceptor addicional (Freidenberg GR, 1988).
1.2.2.2. Substrats del receptor de la insulina (IRS)
Expressió genètica: L’expressió del gen del substrat IRS-1 es troba reduïda en els
adipòcits d’individus amb DM2 obesos (Rondinone CM, 1997)
Associacions genètiques: Al substrat IRS-1 s’han descrit cinc mutacions, només
l’anomenada G972R s’ha descrit associada a resistència a la insulina tant en individus amb
DM2 com en població sana (Yoshimura R, 1997).
1.2.2.3. Subunitat de la PI3-K p85
Associacions genètiques: En població general, s’ha descrit una associació genètica
entre la mutació anomenada M326I i la resistència a la insulina. Els individus homozigots
20
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
per aquesta mutació presenten una reducció de sensibilitat a la insulina (Hansen T, 1997).
1.2.2.4. Transportadors de glucosa
Mutacions: Per la seva expressió en els teixits diana de la insulina i la seva
regulació per insulina, el transportador Glut-4 ha estat el més estudiat. Les mutacions en el
gen que codifica el Glut-4 en els individus amb DM2 són rares i presenten la mateixa
prevalença que a la població general.
Expressió genètica i funció proteica: S’han trobat alteracions en el nombre i funció
del transportador Glut-4 i també en la seva translocació. Així, els adipòcits de pacients amb
DM2 o amb obesitat mostren un descens del transportador que es correlaciona amb un
descens del seu mRNA. En canvi, en el múscul esquelètic les concentracions són normals,
però presenten una menor capacitat de la insulina per translocar-los a la membrana (Kahn
BB, 1992).
1.2.2.5. La glicogen sintasa
Expressió genètica i funció proteica: La síntesi de glucogen, producte d’aquest
enzim, està marcadament reduïda en el múscul dels individus amb DM2.
Associacions genètiques: S’han descrit polimorfismes en el gen de la glicogen
sintasa associats a diabetis amb alta agregació familiar a Finlàndia (Kahn CR, 1994), però
els resultats no s’han reproduït en altres poblacions (Kadowaki T, 1993).
A part d’aquestes alteracions genètiques puntuals, s’han descrit possibles
mecanismes moleculars mediadors de resistència a la insulina mitjançant diversos factors
que sabem que formen part en el metabolisme de la glucosa i que s’han trobat alterats tant
en l’obesitat com en la DM2. En el següent apartat descriurem els mecanismes moleculars
d’aquests factors que han tingut més ressò o els que encara són avui en dia motiu d’estudi.
21
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.2.3. MECANISMES CEL·LULARS ASSOCIATS A RESISTÈNCIA A LA
INSULINA
1.2.3.1. La hiperglucèmia
La pròpia hiperglucèmia disminueix la sensibilitat a la insulina, així com la secreció
d’aquesta hormona, un fenomen comunament conegut com a toxicitat de la glucosa
(Rossetti L, 1995) o glucotoxicitat. Existeixen dues teories que intenten explicar com la
hiperglucèmia indueix a la resistència a la insulina: pels productes hexosamina o per
l’activació de la proteïna quinasa C (PKC). Pel que fa a la hexosamina, es coneix que entre
el 2% i el 4% de la glucosa captada per un teixit és desviada de la via glucolítica a nivell de
la fructosa 6-P cap a la via hexosamina per formar glucosamina-6-P i altres productes
hexosamina (McClain DA, 1996). S’ha demostrat que l’exposició del múscul esquelètic a
glucosamina redueix la translocació del transportador de glucosa GLUT-4 (Baron AD,
1995). Quant a la segona teoria de la PKC, sembla que la seva activació per nivells elevats
de glucosa dóna lloc a la fosforilació del receptor d’insulina en serina i es produeix una
inhibició de la seva activitat (Kellerer M, 1995).
1.2.3.2. El PPAR
Relacionada amb el teixit adipós, una molècula darrerament estudiada és el receptor
activat per proliferadors de peroxisomes gamma (PPAR). Pertany a una família de
receptors nuclears involucrats en la regulació de gens que inclou, a més a més, el PPAR i
el PPAR. El PPAR s’expressa poc en el múscul i en el fetge; en canvi, al teixit adipós
l’expressió és elevada i funcióna com a important regulador de l’adipogènesi (Spiegelman
BM, 1998).
Els resultats d’estudis amb animals deficients del gen del PPAR i de variacions en
el gen en humans són consistents, amb un paper secundari d’aquesta molècula amb la
sensibilitat a la insulina. No obstant això, no tots coincideixen. Així, mentre que s’han
descrit mutacions que donen lloc a una proteïna deficient en funció que s’associen a
22
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
millora de sensibilitat a la insulina (Ristow M, 1998), també s’han descrit mutacions en el
domini d’unió en individus amb resistència a la insulina severa (Barroso I, 1999).
En aquest mateix sentit és conegut que les tiazolidinediones (TZDs), els nous
“sensibilitzadors d’insulina” utilitzats en pacients amb resistència a la insulina, són lligants
d’alta afinitat pels PPAR. Els efectes de les TZDs mitjançant el PPAR en l’increment de
la sensibilitat a la insulina en el fetge i el múscul podrien ser directes, ja que la millora de
RI s’ha comprovat en absència de teixit adipós (Burant CF, 1997), o bé indirectes,
mitjançant primers efectes sobre el teixit adipós transmesos als altres teixits via canvis en
els nivells de mediadors secretats pel teixit adipós com àcids grassos, el factor de necrosi
tumoral alfa (TNF) o la leptina (Spiegelman BM, 1998).
1.2.3.3. Les adipoquines
S’ha demostrat que el teixit adipós pot tenir funcions d’òrgan secretor i com a tal
sintetitzar una varietat de proteïnes que s’han anomenat adipoquines. S’ha suposat que
l’expansió d’aquest teixit als individus obesos dóna lloc a la secreció defectuosa
d’adipoquines, que són alliberades al torrent sanguini i podrien oferir resistència a la
insulina en altres teixits (múscul i fetge, sobretot) o bé podrien actuar de forma paracrina
entre el mateix teixit o els més pròxims a ell. Breument detallarem les que s’hi han vist
més implicades, que són els àcids grassos lliures, la leptina, l’adiponectina i la recentment
descoberta resistina.
a) Els àcids grassos lliures (AGL)
Molts estudis evidencien el nexe entre els nivells plasmàtics d’AGL i la RI en
els teixits diana de la insulina. Els nivells d’AGL es troben elevats a l’obesitat
(Reaven G, 1988) i augments aguts d’aquests nivells incrementen la RI de forma
dosi-dependent, tant en individus diabètics (Boden G, 1995) com no diabètics
(Boden G, 1991). També és conegut que els adipòcits intraabdominals presenten
menys receptors insulínics i més receptors adrenèrgics, cosa que els dóna més
capacitat lipolítica adrenèrgica i, augmenta la disponibilitat d’AGL a la circulació
23
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
portal (Shimomura I, 1993). De fet, estudis amb obesos o amb DM demostren que
nivells alts d’AGL aboleixen completament els efectes de la insulina, i que d’altra
banda, la inhibició de la lipòlisi (amb la subsegüent disminució d’AGL) amb un
antilipolític millora la sensibilitat a la insulina fins a un 50% respecte a la d’un
individu control (Santomauro A, 1999).
La investigació de la localització cel·lular on els AGL regulen la inhibició de
l’acció de la insulina indica defectes en l’ambit del transport de la glucosa o de la
fosforilació de la glucosa a glucosa-6-P (els mètodes utilitzats no permeten
diferenciar entre aquestes dues possibilitats) i de la síntesi de glicogen (Boden,
1995) en el teixit muscular.
El mecanisme molecular no està tampoc del tot comprès. L’efecte d’inhibició
de l’acció de la insulina pels AGL no sembla directa, ja que s’observa un temps de
demora de 3-4 hores. Les darreres investigacions suggereixen que els triglicèrids
intramiocel·lulars del teixit muscular (localitzats dins de les fibres musculars) són
els causants directes de la RI al múscul. D’acord amb aquesta opció, alguns estudis
han demostrat una relació entre el contingut de teixit adipós muscular i la RI (Pan
DA, 1997) i un darrer
estudi descriu una correlació lineal entre els nivells
plasmàtics d’AGL, els nivells de triglicèrids intramiocel·lulars en el múscul i un
augment de resistència a la insulina després de 3,5 hores (Boden G, 2001). El temps
necessari perquè els AGL s’acumulin com a triglicèrids dins el múscul dóna suport
a la proposta d’una relació indirecta AGL-RI.
El paper dels AGL segurament és molt important a l’hora d’explicar la
fisiopatologia de la DM2; en aquest sentit s’ha desenvolupat la teoria de la
lipotoxicitat. A part de la RI en el múscul, un augment de l’alliberament dels AGL
des del greix visceral al sistema portal suposa un increment de la neoglucogènesi,
cosa que interfereix en l’acció de la insulina en el fetge. La RI perpetuaria el cercle
viciós d’hiperestimulació de la cèl·lula beta, que s’aniria deteriorant cap a la
tolerància disminuïda a la glucosa. El deteriorament de la cèl·lula pancreàtica,
incapaç de compensar la RI, conduiria a una progressiva manifestació de la diabetis
(McGarry JD, 1992).
24
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
b) La leptina
La leptina, producte del gen anomenat ob, és secretada principalment pels
adipòcits, sobretot els que formen la grassa subcutània. La leptina actua a nivell del
seu receptor hipotalàmic (db) i inhibeix la producció del neuropèptid Y, el més
potent factor conegut estimulant de la gana. Els resultats són la disminució de la
ingesta, i, mitjançant l’activació del sistema nerviós simpàtic (SNS), un augment
del metabolisme basal i del gast energètic.
El receptor db s’expressa també en teixits perifèrics (fetge, cel·lules 
pancreàtiques i múscul estriat), cosa que implica una funció directa de la leptina
sobre aquests teixits.
Des d’un principi ha existit una relació clara entre els nivells de la leptina i la
sensibilitat a la insulina, sobretot a nivell d’experimentació animal. Els rosegadors
amb defectes en els gens ob o db presenten resistència a la insulina i diabetis. Els
estudis demostren que l’administració de leptina, abans dels seus efectes sobre la
ingesta i en el pes corporal, augmenta la captació de glucosa pels teixits i millora la
sensibilitat a la insulina (Kamohara S, 1997). Existeix controvèrsia entre si aquests
efectes sobre el metabolisme de la glucosa són de forma directa a través dels
receptors ob en els teixits o mitjançant l’activació del sistema nerviós simpàtic
(Kamohara S, 1997), (Liu L, 1998).
Indirectament, la leptina indueix l’increment en oxidació dels àcids grassos
(Muoio DM, 1997), un dels mecanismes pels quals pot millorar la captació de
glucosa. En l’ambit de l’experimentació animal, s’ha descrit també que els nivells
de transcripció del gen de la leptina poden ser inhibits mitjançant activadors del gen
del PPAR, com els TZDs (De Vos P, 1996).
En el humans, però, la relació leptina i resistència a la insulina no està
clarament demostrada i més aviat l’associació real sembla estar entre la leptina i
l’obesitat. En la majoria dels pacients obesos els nivells de leptina circulant són
elevats, i augmenten de forma exponencial amb l’augment de massa grassa corporal
(Considine RV, 1996). Tot i que s’han descrit casos d’obesitat severa per absència
de leptina, els defectes congènits en nivells i funció de la leptina són rars. Al
25
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
contrari, l’obesitat humana sembla un estat de resistència a la leptina, probablement
per defectes en l’ambit del receptor o post-receptor de la leptina (Wurtman RJ,
1996).
c) L’adiponectina
L’Acrp30 (Adipocyte Complement Related Protein), també coneguda com
AdipoQ, apM1 o adiponectina, és una proteïna expressada exclusivament pels
adipòcits diferenciats. Els pacients obesos, amb DM2
o amb malaltia arterial
coronària mostren nivells plasmàtics d’adiponectina inferiors a la població control.
(Arita Y, 1999), (Hotta K, 2000) i (Noriyuki O, 1999). Els nivells plasmàtics
d’aquesta molècula es relacionen inversament amb els nivells d’insulina plasmàtica
i la resistència a la insulina (Weyer C, 2001). En un estudi longitudinal amb
pacients obesos que han reduit el pes per mitjà d’un “bypass” intestinal, els nivells
d’aquesta molècula augmenten amb la reducció del pes i es correlacionen
inversament amb la disminució de l’index de massa corporal (BMI, “body mass
index”) la disminució dels nivells de glucosa i la millora de la resistència a la
insulina.
L’expressió del gen de l’adiponectina s’ha demostrat que és reduïda tant en el
teixit adipós d’individus obesos com en el de ratolins (Hu E, 1996). El gen ha estat
mapat en una regió 3q27, considerada de susceptibilitat genètica per al
desenvolupamentt de la diabetis (Vionnet N, 2000). S’han descrit algunes
mutacions en els exons 2 i 3 del gen i els estudis d’associació s’han dut a terme
sobre tot en poblacions japoneses. Una de les mutacions, la I164T, s’ha observat
significativament més elevada entre una població amb DM2 i associada a nivells
plasmàtics inferiors d’adiponectina (Hidehiko K, 2002).
d) La resistina
Molt recentment, Steppan C i altres, han descobert una nova molècula, que han
anomenat resistina, secretada específicament pel teixit adipós (Steppan C, 2001).
26
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
En el seu treball amb rates genèticament obeses o induïdes amb dieta, els nivells de
resistina augmenten amb la resistència a la insulina i s’hi correlacionen fortament.
L’administració d’un anticòs antiresistina millora la glucosa circulant, així com la
sensibilitat a la insulina d’aquests animals. Per aquests motius s’ha proposat que la
resistina podria jugar un paper en la patogènesi de la resistència en la insulina i el
gen que la codifica representa, per tant, un candidat potencial per a l’estudi de
l’etiologia de la resistència a la insulina en la DM2 o en l’obesitat. En humans,
però, els resultats no han estat tan rellevats. Els estudis “in vitro” demostren que
l’expressió del gen en teixit adipós i muscular de pacients DM2 és quasi
indetectable i semblant a l’expressió dels individus normals. Tampoc troben cap
relació amb la resistència a la insulina ni amb cap paràmetre metabòlic (Nagaev I,
2001), (Janke J, 2002). Dos estudis d’associació entre polimorfismes en el gen de la
resistina i poblacions amb DM2, una japonesa (Haruhiko O, 2002) i una altra
italiana (Sentinelli F, 2002), demostren absència de relació entre els defectes
genètics en el gen de la resistina i marcadors d’obesitat i de resistència a la insulina.
A més a més d’aquestes molècules que hem descrit, el teixit adipós és capaç de
sintetitzar citocines. Les citocines sintetitzades per la cèl·lula adipocitària semblen
intervenir directament o indirectament en el procés de mediació de la RI. En aquest sentit
les citocines més destacades són el factor de necrosi tumoral alfa i la interleucina 6 , que
tot seguit passarem a comentar.
27
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.3. EL FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA
El factor de necrosi tumoral alfa (TNF) va ser originalment aïllat en el sèrum
d’animals infectats inicialment amb Mycobacterium bovis i posteriorment tractats amb
una endotoxina. Va ser descrit com una proteïna capaç de provocar necrosi hemorràgica de
tumors sòlids i en alguns casos completa regressió de tumors trasplantats en ratolins
(Carswell E, 1975). De forma independent, el TNF va ser identificat com a factor
responsable del desgast (caquèxia) observat durant les infeccions cròniques i secretat per
macròfags (Beutler B, 1987).
A partir del seu descobriment, el TNF s’ha aïllat en diversos tipus cel·lulars i
teixits i s’ha relacionat amb un ampli espectre de respostes cel·lulars. Així, és considerat
com una citocina moduladora de la resposta immunitària, inductora d’altres citocines,
proliferadora cel·lular, diferenciadora i apoptòtica.
1.3.1. BIOSÍNTESI I ESTRUCTURA PROTEICA DEL TNF
El TNF defineix una família de citocines globalment coneguda com a factors de
necrosi tumoral que inclou dues altres proteïnes estructuralment i funciónalment
semblants: la linfotoxina- (TNF- o LT-) i la linfotoxina- (LT-). La principal font de
TNF és el fagòcit mononuclear activat pel lipopolisacàrid (LPS o endotoxina),
component actiu de la paret de les bactèries gramnegatives, però també els linfòcits T i B,
les cèl·lules activades de NK, els mastòcits (cèl·lules del sistema immune), el fibroblast, els
osteoblasts, les cèl·lules epitelials de la retina i nombroses línies tumorals en secreten
quantitats significants (Aggarwal B, 1996). El TNF s’expressa també en cèl·lules del
teixit epitelial, com a resposta a la invasió bacteriana, en l’adipòcit i en les cèl·lules del
múscul esquelètic i cardíac (Saghizadeh M, 1996). La producció de TNF és regulada per
nombrosos estímuls. A part de l’endotoxina, també bactèries gram positives, virus (DNA i
RNA), llevats, fongs, mitogens, diverses citocines i nombrosos fàrmacs activen la seva
síntesi. Igualment, estímuls fisiològics com la febre i l’estrès, o les radiacions ionitzants
indueixen la seva síntesi en macròfags (Hallahan D, 1989). La modulació negativa de la
28
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
citocina és induïda per algunes citocines, esteroides, inhibidors de proteases,
fosfodiesterases i de la síntesi de prostaglandines (Nguyen D, 1990).
El TNF és sintetitzada com una proteïna no glucosada de 26 kDa i és
característica la seva posició a la membrana. Aquesta forma de proteïna transmembrana és
biològicament activa i sembla que té el seu paper en les respostes normals del TNF en els
teixits o en certs estadis inflamatoris mitjançant un contacte directe cèl·lula a cèl·lula entre
la citocina i els seus receptors (Grell M, 1996). Un efecte posterior proteolític (Klieger M,
1988) regulat per una activitat serinproteasa de l’enzim conversor del TNF (TACE)
allibera un fragment de 17 kDa a la circulació, s’uneix a altres fragments homòlegs i forma
un homotrímer estable de 51 kDa, (Abbas AK, 1995) (figura 2).
Aquesta conformació en forma de trímers permet una millor unió amb els receptors,
cosa que afavoreix una acció biològica més eficaç. En funció de la concentració de la
citocina, aquestes accions biològiques possiblement són diferents. A causa de l’elevada
afinitat que els receptors d’aquesta citocina presenten per al seu lligant, a concentracions
baixes (aproximadament 10-9 M) actua com a regulador autocrí i paracrí sobre les pròpies
cèl·lules que el sintetitzen. Quan la concentració és elevada, la citocina podria passar al
torrent sanguini i actuar de forma endocrina sobre diferents òrgans diana (Abbas AK,
1995).
Els estudis cristal·logràfics han donat a conèixer l’estructura tridimensional del
TNF i han confirmat la formació de l’homotrímer. Cada subunitat està formada per una
estructura antiparal·lela de tipus “sandwich” (Jones E, 1989). També són àmpliament
conegudes les regions de la molècula essencials per a la unió als receptors i la seva activitat
biològica (Zhang X, 1992).
Figura 2. Esquema de l’estructura de l’homotrímer del TNF
1
Val
H3N
H3N
1
Val
1
Val
NH3
Leu 157
157
Leu
COO
COO
OOC
157
Leu
29
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.3.2. ESTRUCTURA DEL GEN DEL TNF
El gen humà del TNF va ser identificat per Nedwin (Nedwin G, 1985) al braç curt
del cromosoma 6, a la regió 6p21.3. Es troba molt a prop del gen del TNF, a la regió del
complex major d’histocompatibilitat. Té 3 Kilobases (Kb) de longitud i conté 4 exons i 3
introns. Tant el promotor com la zona 3’ no traduïda (3’UTR) del gen contenen regions
conservades en l’evolució que exerceixen un paper en la regulació de l’expressió de la
citocina. El promotor conté llocs d’unió potencials per diversos factors de transcripció
com: els activadors de proteïna d’unio un i dos (AP-1, AP-2), factor de transcripció Kappa
beta (NF-kB), “nuclear factor of activated T cells” (NF-AT), específics de proteïna 1 (SP1), potenciadors de proteïnes d’unió beta (C/EBP) i elements de resposta a l’adenosin
monofosfat (AMP) (figura 3). Aquests factors contribueixen a la complexa regulació del
gen del TNF i la seva interacció pot variar segons el tipus cel·lular i l’estímul
extracel·lular específic (Tsai EY, 1996). El RNA missatger (mRNA) transcrit conté la
seqüència de repetició ----UUAUUUAU---- de 33 nucleòtids de longitud, també present en
altres citocines, factors de creixement i protooncògens (Caput D, 1986). Alguns estudis
suggereixen que d’aquesta seqüència depèn la vida mitjana del mRNA (Kontoyiannis D,
1999).
Figura 3. Esquema de l’estructura del gen del TNF
SP-1 AP-1 C/EBP AP-2
5’
CRE
NF-AT
Regió promotora
NF-kB
TATA
box
Intró 1 2
3
3’UTR
3’
Regió codificant
1.3.3. RECEPTORS DE TNF
El TNF està mancat d’activitat enzimàtica: totes les seves accions són el resultat
de les respostes de la cèl·lula diana a la presència de la citocina. Fins ara, s’han descrit dos
30
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
receptors per mitjà dels quals la citocina regula les seves accions: el receptor de tipus 1
(TNFR1, CD120a, p55 o 55kDa) i el de tipus 2 (TNFR2, CD120b, p75 o 75kDa).
Els receptors són fundadors de la superfamilia de receptors de TNF, la qual inclou
dotze membres, tots ells receptors de membrana a excepció dels anomenats PV- T2 i PVA53R (figura 4) (Smith C, 1990). Presenten l’estructura típica de proteïnes transmembrana,
caracteritzada per una regió extracel·lular, una transmembrana i una citoplasmàtica. La
primera, amb un motiu ric en cisteïnes repetit quatre cops, manté una alta homologia entre
ambdós receptors i és la que defineix la superfamília (Dembic Z, 1990). En canvi,
existeixen diferències importants quant a l’afinitat per al lligant i és superior per al receptor
de tipus 2. Aquesta regió presenta també certa afinitat per a factors de creixement i altres
citocines, cosa que confereix als receptors de TNF un elevat pleotropisme.
La regió intracel·lular, en canvi, presenta només un 30% d’homologia entre els
receptors. El receptor TNFR1 (i el receptor anomenat Fas) conté un motiu denominat
“Death Domain (DD)” el qual s’uneix a proteïnes que també tenen aquest domini. El
TNFR2 (com la resta dels receptors), presenta un motiu menys definit que s’uneix a una
família de proteïnes associades al receptor (TRAF).
Figura 4. Esquema de la superfamília de receptors de TNF
31
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Els receptors s’expressen ubiquament encara que en quocients diferents segons el
tipus cel·lular (Smith C, 1994). Les funcións biològiques del TNFR1 i el TNFR2 no es
coneixen amb exactitud. Sembla que el TNFR1 regula els senyals de TNF més coneguts
incloent l’apoptosi, la citotoxicitat, la diferenciació i la proliferació, i que l’R2 transdueix
les accions metabòliques (Hotamisligil GS, 1997). Alguns estudis apunten, però, cap a una
cooperació dels dos receptors per aconseguir certs efectes biològics, sobretot pel que fa a
la inducció de citotoxicitat o apoptosi (Weiss T, 1997). En un principi s’havia proposat que
el TNFR2, més que transduir el senyal, estaria implicat en un mecanisme de pas de lligant
del TNF al TNFR1, que seria el que realment transmitiria el senyal (Tartagalia L, 1993).
Nous estudis, però, suggereixen que en moltes situacions el TNFR2 actua mitjançant el seu
domini intracel·lular com un senyal additiu al TNFR1 (Declercq W, 1998).
S’han descrit dues formes solubles del receptor (sTNFR1 i sTNFR2) que es
generen a partir de la proteòlisi de les regions extracel·lulars dels receptors per un
mecanisme anomenat “shedding” (Brakebusch, 1994). Les formes solubles presenten
major afinitat pel TNF que els seus homòlegs de membrana, de forma que s’estableix
entre ells una competència per al lligant que modula l’acció del TNF. No obstant això,
també s’ha proposat per les formes solubles (sTNFRs) un paper potenciador de l’acció del
TNF, per preveure així la dissociació de l’homotrímer (Aderka D, 1992), o la generació
d’una resposta cel·lular específica.
1.3.4. ELS GENS DEL TNFR1 I TNFR2
Els gens que codifiquen el TNFR1 i el TNFR2 han estat mapats a les regions 12p13
i 1p36.2, respectivament (Baker E, 1991), (Kemper O, 1994), i presenten una organització
genòmica molt semblant: els dos tenen una longitud similar i el mateix nombre d’exons
(Christian, 1996).
El gen del TNFR2 té una longitud d’aproximadament 26 kb, i està format per 10
exons, 9 introns, la regió promotora i la regió 3’ no traduïda. Les longituds dels introns i
exons estan ben determinades, així com els nucleòtids, que formen les zones donadores i
acceptadores de cada un d’ells. Els exons presenten un rang de longitud entre 35 i 2489 pb
i els introns, d’entre 338 i 7500 pb.
32
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Existeix una correlació entre l’organització genòmica del TNFR2 i l’organització
funcional de la proteïna. L’exó 1 conté el pèptid senyal i les seqüències N-terminal, mentre
que la regió rica en cisteïnes del domini extracel·lular és distribuïda des de l’exó 2 al 6. La
regió transmembrana és codificada per una part de l’exó 6 i l’exó 7 i el domini
intracel·lular pels exons 8, 9 i 10 (figura 5). La posició de la proteòlisi que produeix les
formes solubles del receptor s’ubica dins de l’exó 6, on s’ha identificat el codó que
codifica la prolina 211, aminoàcid essencial perquè es produeixi el “shedding” (Charlotte
H, 1998).
El promotor conté seqüències específiques per a la unió de factors de transcripció
com el NF-kB, factor de regulació de l’interferó (IRF-1), llocs g d’activació d’interferó
(GAS), elements de resposta a AMP o el factor de transcripció Ikaros. També s’ha observat
la presència d’una inusual zona rica en GC.
Figura 5. Esquema de l’estructura del gen-proteïna del TNFR2
PS
Regió Extracel·lular
RT
Regió citoplasmàtica
3’UTR
Proteïna
Gen
Exons
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
PS: Pèptid senyal.
RT: Regió transmembrana
3’UTR: Regió no traduïda en 3’
33
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.3.5. ACCIONS DEL TNF SOBRE EL METABOLISME. ESTUDIS “IN VIVO” I
“IN VITRO” SOBRE ANIMALS D’EXPERIMENTACIÓ
1.3.5.1. Accions del TNF sobre el metabolisme lipídic
Des del descobriment de la citocina es va especular sobre la seva relació sobre el
metabolisme (Beutler B, 1988). En diversos estudis en models animals s’ha demostrat que
el TNF pot exercir funcions sobre el sistema nerviós central, la regulació del metabolisme
intermediari i el balanç calòric en els teixits adipós, muscular i hepàtic.
El TNF és sintetitzat en el teixit adipós tant en rates com en humans i en menor
grau en els teixits muscular esquelètic i cardíac. En el teixit adipós s’han descrit nombroses
evidències del paper d’aquesta citocina sobre el metabolisme lipídic.
S’ha observat tant “in vitro” com “in vivo”, sobre animals d’experimentació que
l’administració de la citocina pot contribuir a augmentar els nivells circulants d’àcids
grassos mitjançant tres accions. D’una banda, el TNF és capaç d`estimular la via
metabòlica de la lipòlisi, cosa que permet un augment dels àcids grassos lliures a la
circulació (Kawakami M, 1987), (Miles PD, 1997). D’altra banda, el TNF pot inhibir
l’activitat i l’expressió de l’enzim lipoproteïna lipasa (LPL) (Hauner H, 1995), (Semb H,
1987), enzim responsable de la captació dels àcids grassos lliures de la circulació al teixit.
Més recentment s’ha demostrat que la citocina pot disminuir l’expressió de certs
transportadors d’àcids grassos (com el FATP i el FAT) en el teixit adipós (Memon RA,
1998).
A més a més, el TNF actua també disminuint l’expressió de gens que codifiquen
per enzims claus en la via metabòlica de la lipogènesi, com l’acetil-Coa-carboxilasa, o
l’àcid gras sintetasa (Pape ME, 1988), (Doerrler W, 1994).
Finalment, diferents estudis han demostrat que el TNF estimula també la
lipogènesi hepàtica (Semb H, 1987), (Krauss RM, 1990) i (Fiengold KR 1990).
34
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.3.5.2. Accions del TNF sobre el metabolisme de la glucosa i acció de la
insulina
El TNF, igual que altres citocines com la interleucina un (IL-1) i el IFN-, també
té un paper important en l’homeòstasi de la glucosa. En rates a les quals s’ha administrat
via parental i de forma crònica la citocina, aquesta és capaç de perjudicar l’acció de la
insulina sobre la disposició de la glucosa en el cos i suprimir la producció de glucosa
hepàtica (Lang CH, 1992). Un efecte similar s’ha observat en experiments amb gossos,
cosa que va advertir d’un paper del TNF en la inducció de resistència a la insulina
perifèrica (Evans DA, 1989).
En aquest sentit, en cultius d’adipòcits d’animals incubats amb TNF, alguns
autors han observat la inhibició de l’expressió del transportador Glut-4 i del contingut
intracel·lular Glut-1 (Stephens JM, 1991 i 1992). Altres estudis han descrit que
l’administració de la citocina en cèl.lules musculars i adipòcits inhibeix l’activitat i
l’expressió de receptors d’insulina i dóna lloc a una disminució de la captació de la glucosa
per el teixits perifèrics (Charron MJ, 1990).
Atesos aquests efectes sobre l’acció de la insulina, alguns investigadors han
examinat els efectes del TNF en passos molt pròxims al senyal de la insulina. Com s’ha
descrit en l’apartat de l’acció de la insulina, el seu senyal comença amb l’autofosforilació
del seu receptor i es transdueix per cascades de fosforilacions de diversos substrats com el
de tipus 1 (IRS-1), que pot considerar-se el principal mediador del seu senyal. Diverses
evidències sostenen que el TNF pot alterar l’activitat del receptor d’insulina i provocar
una disminució del consum de glucosa cel·lular regulat per insulina.
D’una banda, l’exposició crònica de la citocina en cultius d’adipòcits 3T3-L1 causa
inhibició segons la dosi de l’autofosforilació del receptor insulínic i de la fosforilació en
residus tirosina de l’IRS-1 (Hotamisligil GS, 1994), (Hotamisligil GS, 1996). Efectes
similars han estat observats en cultius de cèl·lules hepàtiques de rata (Feinstein R, 1993).
Guo D descriu el mateix efecte sobre l’IRS-1 també en cultius 3T3-L1, però al cap de 30
minuts o menys d’incubar-los amb TNF, i implica altres proteïnes del senyal de la
insulina com la fosfatidilinotisol-3-quinasa (Guo D, 1996).
35
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Un efecte candidat a provocar disminució neta en el senyal de la insulina és un
increment en la fosforilació en els residus serina/treonina (Ser/Thr) de l’IRS-1. Aquest
tipus de fosforilació s’ha observat en resposta al TNF (Hotamisligil GS, 1996), (Paz K,
1997). Aquest efecte és molt interessant, ja que s’ha descrit una forta correlació entre la
resistència a la insulina i la fosforilació en aquest residu i perquè perturbacions com la
hiperinsulinèmia que provoquen un increment d’aquesta fosforilació poden atenuar el
senyal d’insulina.
El mecanisme molecular exacte pel qual el TNF indueix aquests tipus de
fosforilacions no és clar, però alguns estudis han suggerit que isoformes de la proteïna
quinasa C hi són implicades (Kellerer M, 1998).
En canvi, els treballs realitzats per Stephens JM i altres suggereixen que la principal
raó per la qual el senyal d’insulina és reduït en resposta a una exposició crònica de TNF
és la inhibició de l’expressió de gens que codifiquen per proteïnes substrats del receptor
d’insulina i del receptor de la insulina (Stephens JM, 1997).
Quan s’han realitzat estudis per observar l’efecte de la neutralització del TNF (en
rates Zucker obeses i diabètiques) mitjançant l’administració d’un anticòs anti-TNF, s’ha
confirmat que provocava una millora de l’activitat del receptor insulínic tant en el múscul
com en el teixit adipós, i, per tant, una millora de la disposició de glucosa regulada per
insulina per aquests teixits. En canvi, no s’apreciaven variacions significatives en
l’activitat dels receptors hepàtics. El fet que la millora en la sensibilitat a la insulina es doni
només en aquells teixits que sobreexpressen aquesta citocina, va suggerir que molt
probablement el TNF actuï de forma autocrina o paracrina sobre el mateix teixit.
A la taula 2 resumim els mecanismes descrits anteriorment.
36
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Taula 2. Mecanismes d’acció del TNF sobre el metabolisme lipídic i el de la glucosa
SOBRE EL METABOLISME LIPÍDIC
Mecanisme proposat
Referència
Activació lipòlisi. Augment AGL
Milles PD, 1997
Activació lipogènesi hepàtica
Kraus RM, 1990
Inhibició activitat i expressió de la LPL. Augment AGL
Hauner H, 1995
Inhibició expressió transportadors dels AGL
Memon RA, 1998
Inhibició expressió enzims lipogènesi adipocitària
Doerrler W, 1994
SOBRE EL METABOLISME DE LA GLUCOSA.
Mecanisme proposat
Referència
Inhibició expressió del Glut-1 i el Glut-4
Stephens JM, 1992
Inhibició expressió d’IRS i receptor d’insulina
Stephens JM, 1997
Inhibició de l’autofosforilació del receptor d’insulina
Hotamisligil GS, 1994
Increment de fosforilació en Tyr i en Ser/Thr de l’IRS-1
Hotamisligil GS, 1996
1.3.5.3. Estudis genètics amb models de rates “knock-out”
Potser l’evidència més definitiva del paper del TNF en la sensibilitat a la insulina
sobre tot en l’estat de l’obesitat i diabetis, són els estudis genètics en ratolins mancats del
gen del TNF, d’algun dels seus dos receptors o d’ambdós receptors alhora. Aquest tipus
d’estudis s’anomenen estudis “knock-out” per al gen que ha estat suprimida la seva
activitat. En els treballs que es decriuran a continuació s’estudia l’efecte de la pèrdua de la
funció d’aquests gens en diferents models de rates amb obesitat i en alguns casos també
amb diabetis. L’obesitat és induïda als animals genèticament, mitjançant l’eliminació del
gen de la leptina (ob), amb dieta, per mitjà d’una alimentació amb una dieta hipercalòrica o
bé químicament, amb la injecció de substàncies químiques que produeixen hiperfàgia. La
diabetis s’aconsegueix amb la supressió del gen del receptor de la leptina (db).
37
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
a) Estudis “knock-out” per al gen del TNF
Ventre J i Uysal K demostren de forma independent (Ventre J, 1997 i Ulsay K,
1997) que la funció del TNF en rates proporciona una millora de la tolerància a la
glucosa i de la hiperinsulinèmia. Així, la manca de la citocina confereix una
protecció considerable a la resistència a la insulina durant l’obesitat, tant en les
rates amb obesitat induïda per dieta (en el cas de l’estudi d’Ulsay) com en l’obesitat
induïda químicament (estudi de Venter). No obstant això, la protecció que
confereix la pèrdua de funció d’aquest gen sobre la resistència a la insulina no és
absoluta, cosa que fa pensar als autors en la implicació d’altres factors encara no
identificats com a mediadors d’aquest desordre i, per tant, de l’etiologia
multifactorial de la resistència a la insulina a l’obesitat.
Els dos estudis anteriors també demostren que el TNF pot influir en la
sensibilitat a la insulina mitjançant les seves accions en diversos passos involucrats
en l’acció de la insulina, com ara són el transport de la glucosa, la producció de
leptina i, el senyal del receptor de la insulina, o també sobre el metabolisme de
lípids.
D’un altra banda, altres investigadors sostenien la hipòtesi sobre el paper
fisiològic del TNF com a factor restrictiu de l’increment del teixit adipós
(Hotamisligil G, 1994). Els resultats de Ventre i Uysal no són consistents amb
aquesta hipòtesi, ja que en els dos estudis el grau d’obesitat assolit pels animals
sense la funció de la citocina era pràcticament igual a l’obesitat assolida pels
animals controls.
b) Estudis “knock-out” per als gens dels receptors R1 i R2 del TNF
Pel que fa a la investigació en “knock-out” per als gens dels receptors R1 i R2,
existeixen discrepàncies entre els resultats dels estudis publicats. D’una banda
Shereyer S, (Shereyer S, 1998) descriu que els ratolins amb pèrdua de funció per
algun dels dos receptors presenten poques o cap diferència pel que fa al
desenvolupament de l’obesitat i a la tolerància a la glucosa. Sorprenentment, però,
38
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
en el cas dels ratolins que han perdut les dues funcións dels receptors alhora
presenten una relativa hiperinsulinèmia i hiperglucèmia, de forma que la pèrdua de
funció d’ambdós receptors sembla que està associada a un aparent foment de
resistència a la insulina.
En contrast amb els resultats de Shereyer, un estudi realitzat per Uysal K,
(Uysal K, 1997) amb ratolins “knock-out” amb pèrdua de funció dels dos receptors
alhora revela protecció parcial contra el desenvolupament d’hiperglicèmia i
hiperinsulinèmia, i contra una resposta inferior a la glucosa i insulina exògena.
Així, aquest autor descriu que la pèrdua de funció d’ambdós receptors sembla que
està associda a una aparent protecció per desenvolupar resistència a la insulina.
En un estudi posterior, aquest mateix autor (Uysal K, 1998) descriu el TNFR1
com el receptor del TNF predominant en la regulació l’acció d’aquesta citocina
sobre la sensibilitat a la insulina en el seu model animal de rates obeses.
Les raons de les discrepàncies entre els resultats de Shereyer i els d’Uysal,
romanen per dilucidar. La principal diferència entre el model animal “knock-out”
per ambdós receptors estudiat pels dos autors és que, en el cas de Shereyer,
l’obesitat en les rates era induïda amb una dieta hipercalòrica; en canvi, en el model
animal d’Uysal l’obesitat és induïda genèticament, eliminant el gen de la leptina.
Els autors, però, a més a més d’aquesta diferència, atribueixen les causes de la
discrepància a la possible intervenció d’altres factors que regulen accions sobre la
sensibilitat a la insulina, tal com hem comentat anteriorment en els models “knockout” per al TNF .
Sembla clar, doncs, que el tipus de model animal i la forma d’inducció
d’obesitat-diabetis és clau a l’hora d’interpretar i entendre els mecanismes d’acció
d’aquesta citocina i dels seus receptors en la inducció de resistència a la insulina.
Un resum dels resultats dels estudis “knock-out” per al TNF i per els receptors R1
i R2 es presenta a la taula 3, extreta de Moller DE (Moller, DE, 2000)
39
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Taula 3. Estudis “knock-out” per al gen del TNF i per als seus receptors
ob: gen de la leptina.
db: receptor de la leptina.
ESTUDIS “KNOCK-OUT” PER AL GEN DEL TNF (TNF -/-)
MODEL ANIMAL
FENOTIP METABÒLIC
REFERÈNCIA
Obesitat induïda químicament
- Les
obeses
presenten
millora
parcial de tolerància a la glucosa i
Rata TNF -/-
de la hiperinsulinèmia
Ventre J, 1997
- Aparent protecció de resistència a
la insulina
Obesitat induïda per dieta calòrica
- Obesitat menys pronunciada i més
resistens a la hiperinsulinèmia i a la
intolerància a la glucosa
Rata TNF-/-
- Aparent protecció de resistència a Uysal K, 1997
la insulina
- Nivells àcids grassos lliures baixos
ESTUDIS “KNOCK-OUT” PER AL GEN DEL RECEPTOR R1 (TNFR1
-/-), O RECEPTOR R2 (TNFR2 -/-) I PER A AMBDÓS GENS
MODEL ANIMAL
FENOTIP METABÒLIC
REFERÈNCIA
Obesitat induïda per dieta calòrica
Rata TNFR1 -/-
- Obesitat i tolerància a la glucosa
semblant als controls
Schreyer S, 1998
- Guany de pes reduït versus controls
Rata TNFR2 -/-
i nivells d’insulina inferiors als Schreyer S, 1998
controls
40
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
MODEL ANIMAL
FENOTIP METABÒLIC
REFERÈNCIA
- Obesitat semblant als controls
Rata
- Nivells d’insulina i glucosa més
TNFR1-/- TNFR2-/-
elevats
Schreyer S, 1998
- Aparent foment de resistència a la
insulina.
Obesitat induïda genèticament (rata ob/ob)
- Aparent protecció de resistència a
Rata TNFR1-/-
la insulina
Uysal K, 1998
- TNFR1 com a principal mediador
- Obesitat semblant als controls
Rata
- Parcial protecció d’hiperglucèmia i
TNFR1-/-TNFR2 -/-
hiperinsulinèmia
Uysal K, 1997
- Aparent protecció de resistència a
la insulina
Diabetes induïda genèticament (rata db/db)
Rata TNFR1 -/-
- Cap diferència amb les rates de Schreyer S, 1998
controls.
1.3.6. EL TNF COM A MEDIADOR DE RESISTÈNCIA A LA INSULINA ALS
HUMANS
Tot i que el paper del TNF sobre el metabolisme basal i la sensibilitat a la insulina
en situacions d’obesitat i diabetis ha estat àmpliament documentada sobre estudis “in vitro”
i “in vivo” en models d’animals, en els humans aquestes implicacions de la citocina són
menys conegudes. Això es deu no només a la complexitat dels mecanismes involucrats,
sinó també a la dificutat metodològica per estudiar el TNF. Aquestes dificultats
s’atribueixen a l’elevat grau de labilitat que la citocina presenta durant el processament i la
manipulació de la mostra. Així, la detecció dels valors plasmàtics en humans és laboriosa i
de fet en la literatura existeix discrepància en les seves valoracions.
41
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Diversos estudis en humans donen suport a la hipòtesi que el TNF podria tenir un
paper important en la inducció a la resistència a la insulina a l’obesitat o a la DM2 en els
humans. En aquest sentit, primer comentarem les troballes d’aquesta relació en l’ambit
d’expressió de la citocina en teixits concrets i després les publicades en l’ambit de les
variacions en el gen del TNF.
1.3.6.1. Expressió del TNF en teixit adipós i muscular humà i resistència a la
insulina
En els treballs als quals farem referència, la quantificació de l’expressió de la
citocina en el teixit adipós i muscular es determina amb l’extracció del mRNA de la
citocina a partir del tractament d’una biòpsia del teixit.
Kern PA i Hotamisligil GS demostren de forma independent que en el teixit adipós
de pacients obesos hi ha un augment de l’expressió del TNF respecte als mateixos tipus
cel·lulars dels individus amb d’absència d’obesitat. (Kern PA, 1995 i Hotamisligil GS,
1995) Igualment, Saghizadeh M observa un augment de l’expressió de la citocina en el
teixit muscular de pacients diabètics respecte a les cèl·lules dels individus normoglicèmics
(Saghizadeh M, 1996) .
Els estudis esmentats anteriorment mostren una important relació entre l’expressió
tissular i certes variables relacionades amb la sensibilitat a la insulina. Així, l’expressió de
TNF en els pacients obesos es correlaciona positivament amb els nivells d’insulina
plasmàtica i amb l’índex de massa corporal. També l’expressió de TNF presenta una
correlació inversa amb l’activitat i l’expressió de l’enzim LPL adipocitària. Amb la pèrdua
de pes dels pacients obesos, l’expressió de la citocina decreix, millora la sensibilitat a la
insulina i es recupera l’activitat de l’enzim LPL. Resultats similars s’observen en messurar
els nivells de la citocina plasmàtica, però els autors adverteixen que les concentracions són
molt baixes o quasi indetectables, cosa que dificulta la interpretació dels resultats.
Pel que fa al teixit muscular dels individus diabètics, els increments de l’expressió
de la citocina en aquests pacients s’associaven fortament amb l’augment de glucosa
disponible en el medi.
42
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.3.6.2. Variacions en el gen del TNF humà i resistència a la insulina
Un dels primers estudis que va establir una possible relació entre aquest gen i l’
obesitat va ser descrit en una població d’índis Pima obesos. Aquí, l’autor estableix un
lligament entre un marcador genètic prop del gen del TNF i l’obesitat. Posteriorment es
varen identificar polimorfismes en el promotor del gen del TNF, concretament en les
posicions –238 i – 308, ambdós causats per un canvi de guanina per adenina (Wilson AG,
1992) i (D’Alfonso S, 1994). Diversos treballs en diferents models cel·lulars humans
estudien el significat funcional d’aquests polimorfismes. Alguns grups d’investigadors
coincideixen en què, en el polimorfisme –308, el canvi per adenina o al·lel TNF2 s’associa
a una taxa de transcripció constitutiva i induïda de TNF més alta respecte a l’al.lel TNF1
(Wilson AG, 1997), (Kroeger KM, 1997) i (Wu WS, 1997). En canvi, altres grups no troben
cap diferència en la taxa de transcripció d’aquests dos al·lels (Stuber F, 1995-96) i
(Brinkman BM, 1995-96). Aquestes discrepàncies sembla que estan relacionades amb el
model de cultiu cel·lular, els estimulants per la síntesi de la citocina i de l’estructura del
gen que s’usa en els experiments.
Així doncs, s’obria la possibilitat que aquestes variacions juguessin un paper
determinant “in vivo” sobre l’acció del TNF en la resistència a la insulina. Utilitzant
aquesta hipòtesi, es va dur a terme un estudi en humans del polimorfisme genètic en la
posició –308 del TNF, i es va demostrar per primer cop, una relació entre aquest
polimorfisme, la sensibilitat a la insulina i l’obesitat (Fernandez-Real JM, 1997). En aquest
estudi, els individus portadors de l’al·lel TNF2 presenten un percentatge major de massa
grassa acompanyada de nivells més elevats de leptina i un augment de resistència a la
insulina en comparació amb els individus del mateix sexe, edat, índex de massa corporal i
relació cintura/maluc que no són portadors d’aquest al·lel.
1.3.6.3. Els receptors R1 i R2 del TNF i resistència a la insulina
El treball més rellevant a nivell humà sobre l’expressió dels dos receptors i aquesta
relació amb l’obesitat és el publicat per Hotamisligil GS (Hotamisligil GS, 1997). Aquest
43
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
treball demostra que les dones obeses expressen el doble de mRNA del receptor 2 en el
teixit adipós i sis cops més fracció soluble d’aquest receptor en circulació en relació amb
les dones primes. L’expressió del receptor 2 en aquest teixit es correlaciona fortament amb
l’índex de massa corporal i els nivells d’insulinèmia. En canvi, tant l’expressió del receptor
1 com els seus nivells circulants són similars en tots els individus involucrats en l’estudi.
44
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1.4. LA INTERLEUCINA-6
1.4.1. SÍNTESI I ESTRUCTURA PROTEICA
La
interleucina 6 (IL-6) va ser originalment identificada com un factor de
diferenciació cel·lular (BSF-2) que induïa la maduració final de les cèl·lules T (Hirano T,
1985). Una sèrie d’estudis posteriors confirmaven que aquesta citocina es sintetitza en
diversos tipus de cèl·lules del sistema immune i de cèl·lules accessòries d’aquest sistema
(com monòcits, macròfags, linfòcits, fibroblast, cèl·lules endotelials, etc.). Així, la IL-6 és
una de les principals citocines moduladores de la resposta inflamatòria: inhibeix la síntesi
de TNF- i l’IL-1, activa la síntesi hepàtica de proteïnes de fase aguda i estimula l’eix
hipotalàmic-pituïtari-adrenal (Schindler R, 1990), (Heinrich PC, 1990) i (Lyson K, 1991).
Aquesta citocina és sintetitzada també en cèl·lules no immunitàries i òrgans com
l’osteoblast, els queratinòcits, els condròcits, les cèl·lules de l’epiteli intestinal, les
cèl·lules de Leydig, els adipòcits, etc. Es caracteritza per ser marcadament pleitròpica i
participar en la regulació de diverses funcións metabòliques i endocrines.
La producció d’IL-6 es regulada positivament o negativament per diversos estímuls
segons els tipus cel·lular. En presència de lipopolisacàrids, diferents virus i diverses
citocines (TNF, factor de creixement derivat de plaquetes (PDGF), interferó ) s’activa la
síntesi d’aquesta citocina, mentre que en presència de glucocorticoides s’inhibeix.
L’estructura proteica de la interleucina-6 consisteix en 184 aminoàcids amb dos
llocs potencials de glicosilació i quatre residus cisteïna, aquests darrers altament conservats
en l’evolució i amb un paper crític per a l’activitat de la citocina.
1.4.2. ESTRUCTURA DEL GEN DE LA IL-6
El gen es localitza al braç curt del cromosoma 7, concretament a la regió 7p21-p15
(Ferguson-Smith AC, 1988). Consisteix en 5 exons i 4 introns i presenta una complexa
regulació de la seva transcripció. El promotor del gen conté diversos llocs de
reconeixement per a factors de control de la transcripció com el factor nuclear de la IL-6
(NF-IL6), que pertany a la família C/EBP, el factor NF-kB, que és el major mediador de
45
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
l’estímul inflamatori
(Matsusaka T, 1993) i d’altres com elements de resposta a
glucocorticoides (GRE), elements de resposta a AMP (CRE) i activadors de proteïnes
d’unió 1 (AP-1) (figura 6).
Figura 6. Esquema de l’estructura del gen de la IL-6
GRE
AP-1 CRE NF-IL6
NF-kB
TATA
box
Intró 1
2
3
4
regió 3’UTR
3’
5’
Regió promotora
Regió
codificant
1.4.3. RECEPTOR DEL LA IL-6. ESTRUCTURA I TRANSDUCCIÓ DEL
SENYAL
1.4.3.1. Estructura del receptor de la IL-6 i del gp130
Es tracta d’un receptor de membrana amb les regions típiques: extracel·lular,
transmenbrana i intracel·lular. A la regió extracel·lular s’hi diferencia una porció
d’aproximadament 100 aminoàcids d’un domini que pertany a la superfamília
d’immunoglobulines i que no sembla important per a la unió del lligand IL-6. La segona
porció conté els dominis que caracteritzen aquesta família de receptors: 4 residus cisteïna i
un motiu Triptòfan-Serina-X-Triptofan-Serina (WSXWS), aquest darrer amb funció
d’interacció amb la IL-6 (Miyajima A, 1992).
La regió intracel·lular conté només 80 aminoàcids i està mancada de qualsevol
motiu conegut per transduir el senyal. Per aquest darrer motiu la unió de la IL-6 al seu
receptor s’associa a una molècula de 130-kDa anomenada gp130, que és la que transdueix
el senyal cap a la cèl·lula. Gp130 també és una proteïna transmembrana. La regió
extracel·lular conté motius típics d’una família de
receptors de citocines, descrits
anteriorment, però la regió intracel·lular conté llocs intrínsecs d’activació tirosina-quinasa
(figura 7).
46
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Figura 7. Esquema de l’estructura del receptor de la IL-6 i el gp130
gp130
Receptor
IL-6
Domini Ig
Domini cisteïna
Domini wsxws
MEMBRANA CEL·LULAR
Llocs activació
Tirosina quinasa
1.4.3.2. Mecanisme de transducció del senyal per mitjà de gp130
L’estimulació de la IL-6 mitjançant la unió amb el seu receptor de membrana o amb
la fracció soluble del receptor sembla que indueix l’homodimerització de la proteïna
gp130. A conseqüència d’aquesta unió s’activen proteïnes JAK-quinases (JAKs) que
permeten la fosforilació en tirosina de la part més distal de la regió intracel·lular del gp130,
cosa que permet la dimerització de proteïnes STAT3. Aquestes darreres proteïnes són
translocades cap al nucli per modular l’expressió de gens, com els que codifiquen per a
proteïnes de fase aguda.
Un altra via d’activació de gens de proteïnes de fase aguda, mitjançant IL-6 i
gp130, és per l’activació d’una proteïna tirosina-quinasa encara no identificada seguida de
cascades quinasa Ras-MAP i que finalitza amb l’activació del factor de transcripció NFIL6 (figura 8).
47
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Figura 8. Esquema de la transmissió dels senyals de la IL-6
Dímer
gp130
MEMBRANA CEL·LULAR
JAKs
Proteïna quinasa
P
Ras-MAP
STAT3
MEMBRANA NUCLEAR
STAT3
NF-IL6
TRANSCRIPCIÓ GENÈTICA
1.4.4. ACCIONS DE LA IL-6 SOBRE EL METABOLISME. ESTUDIS “IN VIVO”
I “IN VITRO” SOBRE ANIMALS D’EXPERIMENTACIÓ.
S’ha demostrat que la IL-6 redueix l’activitat de l’enzim LPL adipocitària tant “in
vivo”, en el teixit adipós de ratolí, com “in vitro”, sobre cultius de cèl·lules 3T3-L1
(Greenberg AS, 1992). També en rates s’ha observat que l’administració intravenosa d’IL-
6 indueix una hipertrigliceridèmia de forma dosi-dependent mitjançant l’estimulació de la
secreció de triglicèrids al teixit hepàtic (Nonogaki K, 1995).
1.4.4.1. Paper de la IL-6 sobre el metabolisme en humans
En els humans hi ha pocs estudis sobre els possibles efectes de la IL-6 sobre el
metabolisme lipídic o sobre la glucosa en individus obesos o amb DM2. Fins a la
publicació dels nostres articles sobre la IL-6 (estudis 3 i 4), els estudis “in vitro” i “in vivo”
demostren que la IL-6 és secretada tant pel teixit adipós humà subcutani com visceral. La
secreció d’aquesta citocina s’ha observat més elevada en individus obesos i els nivells
48
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
INTRODUCCIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
circulants d’IL-6 es correlacionen fortament amb marcadors d’obesitat com el BMI, la raó
cintura maluc (WHR, “waist-hip ratio”) i el percentatge de massa grassa (Vgontzas AN,
1997), (Mohamed-Ali V, 1997). També l’administració d’IL-6 sembla que està associada a
un augment en la circulació d’àcids grassos lliures (Stouthard JM, 1995).
S’ha proposat que aquesta citocina pot tenir un paper en la modulació del
metabolisme de la glucosa en el teixit adipós en una situació d’ingesta. En aquest sentit,
Orban Z demostra que els nivells d’IL-6 en el fluid intresticial de teixit adipós subcutani
augmenten postprandrialment i ho fan de forma paral·lela amb els nivells de glucosa i els
d’insulina (Orban Z, 1999).
D’altra banda, la IL-6, junt amb el TNF i la IL-1, és la màxima responsable de la
modulació de la transcripció dels gens que codifiquen per les proteïnes de resposta de fase
aguda en el fetge. Aquestes proteïnes augmenten o disminueixen els seus nivells circulants
en situacions d’infeccions agudes, traumatismes o neoplàsies per tal de restablir
l’homeòstasi. Aquestes situacions s’acompanyen d’una dislipèmia típica i molt semblant a
la que s’observa en els individidus amb DM2: hipertrigliceridèmia, augment de VLDL i
disminució de les HDL i LDL inalterades. Alguns autors donen suport a la hipòtesi que la
IL-6 és la responsable d’aquestes anomalies lipídiques que es donen en els individus amb
DM2 i, sobretot, en aquells amb més característiques de la síndrome metabòlica. Aquesta
hipòtesi esmentada es basa en el fet que diferents autors han demostrat un augment en la
circulació d’aquests pacients de proteïnes de fase aguda (proteïna C reactiva, cortisol,
fibrinogen, etc.) paral·lelament amb la dislipèmia típica de la malaltia (PicKup JC, 1997).
1.4.4.2. Estudis genètics de la IL-6 en humans.
D’altra banda, també són limitats els estudis genètics i els estudis d’associació de
polimorfismes d’aquesta citocina en la població humana. Només un estudi en individus
anglesos analitza la regió promotora del gen. Els autors citen un polimorfisme en la posició
–174 provocat per un canvi degut a una transverssió G>C i observen una associació de
l’al·lel G a taxes de transcripció del gen més elevades (Fishman D, 1998).
49
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
OBJECTIUS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
2. OBJECTIUS
50
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
OBJECTIUS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Els objectius plantejats en els treballs que formen aquesta tesi són els següents:
ESTUDI 1.
Plasma levels of the soluble fraction of tumor necrosis factor receptor 2 and insulin
resistance. Diabetes 47:1757-62, 1998.
1- Analitzar el paper de les fraccions solubles circulants dels receptors 1 i 2 del TNF en la
possible mediació a resistència a la insulina en una població obesa.
2- Determinar la correlació entre les fraccions solubles circulants dels dos receptors i certs
marcadors d’obesitat i resistència a la insulina.
ESTUDI 2.
Polymorhism of the tumor necrosis factor- receptor 2 gene is associated with
obesity, leptin levels, and insulin resistance in young subjects ans diet-treated type 2
diabetic patients. Diabetes Care 23:831-37, 2000.
1- Analitzar genèticament la regió no traduida (3’ UTR) del gen del del receptor 2 del
TNF.
2- Avaluar si les variacions trobades participen en la predisposició genètica a obesitat o a
determinats factors de risc.
ESTUDI 3.
Interleukin-6 gene polymorphism and insulin sensitivity. Diabetes 49:517-20, 2000.
1- Analitzar el polimorfisme C>G en la posició –147 del promotor del gen de la
interleucina 6 en la possible participació en la predisposicio genètica al grau de
resistència a la insulina en una població sana.
51
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
OBJECTIUS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ESTUDI 4.
Interlekin-6 gene polymorphism and lipid abnormalities in healthy subjects. J Clin
Endocrinol Metab 85:1334-39, 2000.
1- Analitzar el polimorfisme C>G en la posició – 147 del promotor del gen de la
interleucina 6 sobre la seva possible participació en la predisposicio genètica a presentar
anomalies en els nivells ciculants dels paràmetres lipídics en una població sana .
52
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3. MATERIALS I MÈTODES
53
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
MATERIALS I MÈTODES
3.1. SUBJECTES MOTIU D’ESTUDI
1.1 Estudi 1: població control i obesa
1.2 Estudi 2: població control i amb diabetes mellitus tipus 2
1.3 Estudi 3 i 4: població sana
3.2. RECOLLIDA DE DADES

Paràmetres clínics

Paràmetres antropomètrics. Avaluació de la composició corporal

Paràmetres metabòlics

Paràmetres genètics
3.3. DESCRIPCIÓ DE LA METODOLOGIA

Paràmetres clínics

Paràmetres antropomètrics

Paràmetres metabòlics

Paràmetres genètics
3.4. TRACTAMENT ESTADÍSTIC DE LES DADES
54
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.1. SUBJECTES MOTIU D’ESTUDI
Les poblacions estudiades són d’origen caucasià. Els individus estudiats i les seves
dues generacions prèvies procedents de la conca mediterrània. Els individus amb obesitat o
amb diabetis mellitus tipus 2 van ser diagnosticats per el serveis d’endocrinologia de
l’Hospital Universitari Joan XXIII de Tarragona i per l’Hospital Dr. Josep Trueta de
Girona. Les poblacions control es van seleccionar per a cada estudi dins del mateix
ambient que els pacients. Previ consentiment informat, els subjectes varen acceptar la seva
participació voluntària en els estudis. Els projectes han estat revisats i aprovats per el
Comitè d’Investigació i Ètica d’ambdós hospitals.
3.1.1. ESTUDI 1.
PLASMA LEVELS OF THE SOLUBLE FRACTION OF TUMOR NECROSIS
FACTOR RECEPTOR 2 AND INSULIN RESISTANCE. Diabetes 47:1757-62, 1998.
Població Control (n = 16)
Criteris d’inclusió:
- Pes estable al menys tres mesos abans de l’estudi.
- Índex de massa corporal
< 27 Kg/m2 (homes).
< 25 Kg/m2 (dones)
- Normotensos i Normolipídics.
- Absència de malaltia sistèmica i metabòlica, de qualsevol infecció i de
tractament amb fàrmacs.
Població Obesa (n=20) (obesitat moderada o de grau II de Garrow). Diagnosticats
segons l’índex de massa corporal (BMI), (Garrow GS, 1985).
Criteris d’inclusió:
- Pes estable al menys tres mesos abans de l’estudi.
- Índex de massa corporal >30 < 40 kg/m2.
- Absència de malaltia sistèmica i metabòlica (tret d’obesitat), de qualsevol
infecció i de tractament amb fàrmacs.
55
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.1.2. ESTUDI 2.
POLYMORPHISM OF THE TUMOR NECROSIS FACTOR- RECEPTOR 2
GENE IS ASSOCIATED WITH OBESITY, LEPTIN LEVELS, AND INSULIN
RESISTANCE IN YOUNG SUBJECTS AND DIET-TREATED TYPE 2 DIABETIC
PATIENTS. Diabetes Care 23:831-37, 2000.
Població Control (n = 107)
Criteris d’inclusió:
- Pes estable tres mesos abans de l’estudi.
- Índex de massa corporal < 40 Kg /m2.
- Normotensos i Normolipídics.
- Absència de malaltia sistèmica i metabòlica (tret d’obesitat), de qualsevol
infecció i de tractament amb fàrmacs.
Població amb Diabetis Mellitus Tipus 2 (DM2) (n =110). El diagnòstic de
diabetis mellitus tipus 2 es va realitzar segons els criteris del Comitè Expert en el
Diagnòstic i Classificació de la Diabetis Mellitus. (Report of The Expert Committee
on the Diagnosis and Classification of Diabetis Mellitus, 1997).
Criteris d’inclusió:
- Índex de massa corporal
< 40 Kg / m2 .
- Control metabòlic estable durant els 6 mesos previs a l’estudi.
- Sense història de cetoacidosi.
Criteris d’exclusió:
- Malaltia hepàtica, neurològica, endocrinològica o altres malalties
sistèmiques majors, incluint les neoplàsies.
- Història d’abús de drogues o alcohol, definida com a la ingesta de més de
80g. diaris als homes, i més de 40g. a les dones; o bé activitat sèrica de les
transaminases augmentada tres cops el límit normal.
- Creatinina sèrica elevada.
- Presència de malaltia cardiovascular aguda durant els 6 mesos previst
l’estudi.
56
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
- Malaltia aguda i evidència de malaltia inflamatòria o infecciosa crònica o
aguda.
3.1.3. ESTUDI 3.
INTERLEUKIN-6 GENE POLYMORPHISM AND INSULIN SENSITIVITY.
Diabetes 49:517-20, 2000.
3.1.4. ESTUDI 4.
INTERLEUKIN-6 GENE POLYMORPHISM AND LIPID ABNORMALITIES IN
HEALTHY SUBJECTS. J Clin Endocrinol Metab 85:1334-39, 2000.
Població Sana (n = 32) (Població per l’estudi 3 i 4)
Criteris d’inclusió:
- Pes estable durant al menys tres mesos abans de l’estudi.
- Índex de massa corporal < 40 Kg /m2.
- Absència de malaltia sistèmica i metabòlica (tret d’obesitat), de qualsevol
infecció i de tractament amb fàrmacs.
57
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.2. RECOLLIDA DE DADES ENTRE TOTS ELS ESTUDIS
PARÀMETRES CLÍNICS

Dades de filiació (nom, adreça i telèfon)

Edat

Sexe

Pes

Alçada

Índex de massa corporal (BMI, “body mass index”)

Grau d’obesitat

Tensió arterial

Història familiar de diabetes mellitus tipus 2
PARÀMETRES
ANTROPOMÈTRICS
(AVALUACIÓ
DE
LA
COMPOSICIÓ
CORPORAL)

Raó Cintura-Maluc (WHR, “waist-hip ratio”)

Plec bicipital (BSF, biceps skinfold thickness”)

Plec tricipital (TSF, (“triceps skinfold thickness”)

Plec subescapular (SSF, “subscapular skinfold thickness” )

Plec abdominal (ASF, “abdominal skinfold thickness”)

Àrea muscular del braç (MAMA, “mid-arm muscle area”)

Circumferencia muscular del braç (MAMC, “mid-arm muscle circumference”)

Massa grassa i percentatge de massa grassa (FM, “fat mass”)

Massa magra (FFM, “fat free mass”)
PARÀMETRES METABÒLICS

Nivells de Glucosa

Nivells d’Insulina
58
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010

Nivells de colesterol total

Nivells de lipoproteïnes de molt baixa, baixa i alta densitat (VLDLC, LDLC i
HDLC)

Nivells de triglicèrids i VLDL-triglicèrids

Nivells d’àcids grassos lliures (FFA, “free fatty acids”)

Nivells d’hemoglobina glicosidada (HbA1c)

Nivells de les fraccions solubles dels receptors 1 i 2 del TNF (sTNFR1,
sTNFR2 o sTNFRs)

Nivells de interleucina 6 (IL-6)

Nivells de leptina

Nivells de globulina (CBG) i globulina glicosidada transportadora de cortisol

Fórmula leucocitària i recompte de cèl·lules blanques

Índex de sensibilitat a la insulina (SI) i efectivitat de la glucosa (SG)

Àrea sota la corba d'insulina i de glucosa (AUCinsulina i AUCglucosa)
PARÀMETRES GENÈTICS

Anàlisi de la regió 3’ no traduïda (3’UTR) del gen del receptor 2 del factor de
necrosi tumoral alfa

Anàlisi del polimorfisme de restricció G>C a la posició – 174 del gen de la
Interleucina 6
59
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.3. DESCRIPCIÓ DE LA METODOLOGIA
3.3.1. PARÀMETRES CLÍNICS
3.3.1.1. Índex de Massa Corporal (BMI)
L’índex de massa corporal equivalent a l’índex de Quetelet (Quetelet LAS, 1869) és
un paràmetre clínic que està en funció del pes i de l’alçada de l’individu. Es calcula segons
la fórmula:
BMI = pes (Kg) / alçada2 (m)
3.3.1.2. Grau d’Obesitat
Es diferencien quatre grups segons el BMI (Garrow GS, 1985):
-
Normopés o grau de Garrow : BMI < 25 Kg/m2
-
Sobrepés o grau I de Garrow : BMI entre 25 i 29.9 Kg/m2
-
Obesitat moderada o grau II de Garrow : BMI entre 30 i 39.9 Kg/m2
-
Obesitat mòrbida o grau III de Garrow: BMI > 40 Kg/m2
3.3.1.3. Determinació de la Tensió Arterial
Es determina entre les 8 i 9 hores del matí, amb l’individu assegut i després de 5
minuts de repòs. S’utilitza un esfingomanòmetre de mercuri. El primer i cinquè sorolls de
Korotkoff foren els indicadors de la pressió arterial sistòlica (TAS) i la diastòlica (TAD),
respectivament. La xifra de la tensió arterial calculada per a cada individu va ser la mitjana
de tres lectures amb tres minuts d’interval entre elles.
60
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.3.2. PARÀMETRES ANTROPOMÈTRICS. AVALUACIÓ DE LA
COMPOSICIÓ CORPORAL
Per avaluar la composició corporal (grassa corporal total i musculatura esquelètica)
es van utilitzar dos mètodes:
- Les mesures antropomètriques.
- L'anàlisi de la impedància bioelèctrica.
3.3.2.1. Mesures Antropomètriques
El material tècnic es compost de:
-
Bàscula clínica estàtica de plataforma amb tallímetre que permet determinar
el pes i l’alçada de l’individu de forma consecutiva .
-
Cinta mètrica flexible, calibrada en mil·límetres.
-
Lipocalibrador Lipocaliper de Holtain, (Cambridge, Regne Unit), utilitzat
per a la mesura dels plecs cutanis.
-
Monitor de composició corporal Holtain BC Analyser, per anàlisi de la
impedància bioelèctrica.
a) Raó Cintura/Maluc (WHR)
D’acord amb Vague (Vague J, 1947), la raó cintura/maluc (WHR) es calcula de
la forma següent:
WHR = Circumferència de la cintura / Circumferència del maluc
Circumferència de la cintura
Es determina la circumferència més estreta possible a nivell periumbilical.
Aquesta mesura és la que està més correlacionada amb el risc cardiovascular i la
reserva pancreàtica. (Kohrt WM, 1993) i (Weidner MD, 1995).
61
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Circumferència del maluc
Estant l’individu aixecat i amb roba interior, es determina la circumferència
més àmplia a nivell dels glutis.
b) Mesura dels Plecs Cutanis
Es mesuren amb un lipocalibrador tipus Holtain, (Cambridge, Regne Unit) el
qual exerceix una pressió constant de 10g/mm2. S’ha utilitzat sempre el mateix
aparell per a totes les mesures, amb una aproximació de 2 mm. Per tal d’evitar el
biaix interobservador, totes les mesures les ha fet el mateix individu.
Mètode:
- Previ a l’acte de pessigar, cal localitzar el punt anatòmic exacte amb l’ajuda de
la cinta mètrica.
- El plec es pren amb els dos dits separats aproximadament 8 centímetres.
S’aixeca la pell 1 centímetre i es manté fins la mesura.
- Els braços del lipocalibrador es mantenen en posició horitzontal per tal d’evitar
un biaix de la mesura. Es comprimeix la pell i es llegeix al cap de com a mínim
dos segons d’haver començat a pessigar. S’agafa una fiabilitat en la lectura de
0.1 mm.
- En el còmput final s’agafa la mitjana de tres lectures consecutives.
Plec bicipital:
El subjecte d’empeus, relaxat i amb les mans mirant cap endavant, es pessiga
en la línia mitja en la zona anterior del bíceps i un centímetre més alt que el plec del
bíceps. La direcció del plec és vertical.
62
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Plec tricipital:
El subjecte d’empeus, flexiona el braç 90º per poder localitzar el punt. Exten el
braç i es pessiga en la línia mitja en la zona posterior en el punt mig entre l’acromi i
l’olècran. La direcció del plec és vertical.
Plec subescapular.
El subjecte d’empeus amb els braços paral·lels al cos. Es pessiga en la zona
immediatament inferior a l’angle de l’escàpula. El plec és oblic, formant 45º amb la
línia horitzontal i seguint les línies dels plecs de la pell.
Plec abdominal.
El subjecte d’empeus amb els braços lleugerament separats. Es pessiga en la
regió adjacent al melic en direcció vertical.
c) Àrea Muscular del Braç (AMB)
Aquest paràmetre és un índex de massa muscular (Ricart W, 1993). S'ajusta a
l’equació:
AMB = CMB2 / 4 x 0.313
CMB: Circumferència Muscular del Braç
63
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.3.2.2. Impedància Bioelèctrica
Aquesta tècnica aprofita el fet de què un corrent elèctric d’alta freqüència i de
baix voltatge i intensitat es condueix de forma diferent segons el teixit. El corrent
no atravessa amb la mateixa facilitat el teixit gras, el muscular o un fluid com
l’aigua cosa que es coneix com resistència biolèctrica. Mitjançant un monitor de
composició corporal Holtain BC Analyser es van determinar la massa grassa (kg)
(FM), el percentatge de massa grassa (%) i la massa magra (kg) (FFM).
3.3.3. PARÀMETRES METABÒLICS
Després d’un dejú de com a mínim 12 hores, a primera hora del matí es procedeix a
l’extracció de mostres sanguínies mitjançant una única punció a la vena antecubital amb un
sistema d’extracció al buit (Vacutainer, Becton Dickinson, USA). Les mostres de sang
venosa es van recollir i processar de forma diferent segons les determinacions a realitzar.
1.- Mostres de sèrum per a les determinacions dels paràmetres lipídics (colesterol total,
VLDLc, LDLc i HDLc, triglicèrids, VLDL-triglicèrids), leptina i la forma glicosidada
de la globulina transportadora de cortisol. Es centrifuguen a 3.000 g
a 4ºC i el
sobrenedant es crioperserva en al.líquotes a – 70ºC fins les determinacions
corresponents.
De la mateixa forma es tracten les mostres per a les determinacions sèriques de glucosa
i d’insulina durant els dos tests de tolerància a la glucosa. Les determinacions d’aquest
dos paràmetres però, es realitzen de forma immediata a l’extracció del sobrenedant.
2.- Mostres de plasma per a les determinacions de sTNFRs, nivells d’IL-6 i globulina
transportadora de cortisol, es van recollir en un tub amb EDTA com anticoagulant.
Immediatament es centrifuguen a 3.000 g i a 4ºC i del sobrenedant es fan al.líquotes i
es conserven a – 70ºC fins les determinacions. La resta es destina a l’extracció de DNA
per les determinacions dels paràmetres genètics.
64
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.- Mostres de sang total per a la determinació de l’hemoglobina glicosidada, de la fórmula
leucocitaria i del recompte de cèl.lules blanques.
3.3.3.1. Determinació de la Resistència a la Insulina
a) Test de la Tolerància Oral a la Glucosa (OGTT)
El test es va practicar segons les recomanacions més recents del Comité Expert
en el Diagnòstic i la Classificació de la Diabetis Mellitus (Report of The Expert
Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetis Mellitus, 1997).
Després de 12 hores en dejú l’individu ingereix una concentració de glucosa de
75g, moment que s’estableix com a temps 0. S’obtenen mostres sanguínies als 30
minuts, 60, 90 i 120 minuts per a determinar nivells sèrics de glucosa i d’insulina.
Càlcul de l’àrea sota la corba de glucosa i d'insulina
Es calculen per el mètode trapezoïdal a partir de les determinacions dels seus
nivells de glucosa i insulina durant el test OGTT. En la representació gràfica es
situen en abscisses els intervals de temps entre dues extraccions (30 minuts) i en
ordenades els valors de la variable (glucosa o insulina). El mètode consisteix en
sumar les àrees dels trapezoides formats pels intervals de temps entre dues
extraccions consecutives, com a alçada del trapezoide, i els valors de la variable
consecutius com a bases d’aquests.
b) Test de Tolerància
Intravenosa a la Glucosa de mostreig freqüent
(FSIVGTT)
Aquest test requereix 72 h. d’abstinència de cafeïna i alcohol, i tres dies sense
practicar exercici físic amb una dieta de com a mínin 300 g de carbohidrats / dia.
S'extrauen mostres bassals als minuts -15 i –5, abans de començar el test. Al cap
65
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
d'un minut (temps zero) s'injecten 300 mg/kg de glucosa. Als 20 minuts s'injecten
en forma de bolo, 0.03 U/kg d'insulina el qual es seguit durant 3 hores de freqüents
mostreigs de les concentracions circulants de glucosa i insulina a temps 0 fins a 180
minuts.
Tècnica del model mínim
Al patró de concentracions es van aplicar models matemàtics d'acord amb el
programa informàtic MINMOL (Bergman RN, 1987) per al càlcul aproximat de
l’índex de sensibilitat a la insulina (SI o eliminació de la glucosa mediada per la
insulina) i l’efectivitat de la glucosa (SG o capacitat de la cèl·lula per a estimular la
seva pròpia captació per les cèl·lules). L’índex per sota de 2 x 10-4 uU/ml x min.
indica severa resistència a la insulina, mentre que valors de 5 x 10-4 uU/ml x min.
s’observen en subjectes normals.
3.3.3.2. Determinació de Glucosa
Els nivells de glucosa sèrica durant els dos tests de tolerància a la glucosa es
van determinar per el mètode enzim – colorimètric de la glucosa oxidasa en un
Analitzador Beckman Synchron CX9 Clinical System ALX. El coeficient de
variació va ser de 1.9 %.
3.3.3.3. Determinació d’Insulina
Els nivells d’insulina sèrica durant els dos tests de tolerància a la glucosa es
van determinar mitjançant un assaig immunoradiomètric, seguint les recomanacions
del Kit (IRMA; Medgenix Diagnostics, Fleunes, Belgica). Es tracta d’una tècnica
no competitiva on la mostra amb l’antigen que es vol determinar s’incuba amb un
anticòs fixat a la paret del tub. S’afegeix un segon anticòs marcat amb un radinucli
(traçador) per tal de formar un “sandwitch” on, la quantitat de traçador retingut
augmenta així com augmenta la quantitat d’antigen. El traçador utilitzat va ser I125.
66
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
El complexe radioactiu es va comptar en un comptador gamma. El límit de detecció
més baix va ser 4.0 mU/l. Els coeficient de variació intra-assaig va ser de 5.2% a
una concentració de 10 mU/l i 3.4% a 130 mU/l, i els inter-assaig van ser 6.9% i
4.5% a 14 i 89 mU/l, respectivament.
Anticòs 2
+ Radionúclid
Comptador
gamma
Antigen
Anticòs1
Principi de l’IRMA.
3.3.3.4. Determinació del Colesterol Total
El colesterol sèric total i el de totes les fraccions es va determinar en un
analitzador Beckman Synchron CX9 Clinical System ALX per la tècnica enzimcolorimètrica a punt final que es basa en la reacció de la colesterol esterasa,
colesterol oxidasa i peroxidasa.
3.3.3.5. Determinació de les Lipoproteïnes VLDLc, LDL-c i HDLc
Les VLDL colesterol es van obtenir per el mètode d’ultracentrifugació
convencional a 45.000g. Les HDLc es van precipitar amb una solució salina de
polietilenglicol 6000 (PEG 6000). El subfraccionament en HDL2 i HDL3 va ser
mitjançant la precipitació a concentracions diferents de polietilenglicol (Kostner
GM, 1985).
Les LDLc es van calcular per la fórmula:
LDLc = Colesterol Total – (VLDLc + HDLc)
67
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.3.3.6. Determinació de Triglicèrids i VLDL – Triglicèrids
Els triglicèrids totals i els de la fracció de les VLDL es van determinar en un
analitzador Beckman Synchron CX9 Clinical System ALX per el mètode enzimcolorimètric de la reacció de la glicerolfosfat-oxidasa i peroxidasa (Wahlefeld AW,
1974) .
Els VLDL-triglicèrids es van mesurar després de ser aïllats amb una
ultracentrifugació a 45.000 g.
3.3.3.7. Determinació d’Àcids Grassos Lliures (FFA)
Es van determinar enzimàticament, amb àcid olèic com a estandar
(BioMerieux, Marcy-l’Etoile, France).
3.3.3.8. Determinació de Nivells de l’Hemoglobina glicosidada (HbA1c)
L’hemoglobina glicosilada (HbA1) es va determinar per cromatografia d’alta
resolució en un cromatògraf Hi-Auto A1c Analyzer, model HA-8121 (Kyoto
Daiichi, Japó). La fracció HbA1 indica les concentracions mitjanes de glucosa
durant el cicle vital dels eritròcits. Els coeficients de variació van ser < 4%.
3.3.3.9. Determinació de les Fraccions Solubles dels Receptors 1 i 2 (sTNFR1,
sTNFR2) del TNF i dels Nivells d’IL-6
En qualsevol dels casos es van determinar per enzimimmunoassaig de
sensibilitat amplificada, tècnica “sandwich” seguint les recomanacions del
proveïdor del Kit (EASIA, BioSource Europe, Fleunes, Belgica). El mètode es basa
en un sistema oligoclonal en el qual s’usa una placa de microtitulació recoberta
68
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
d’un conjunt d’anticossos monoclonals dirigits contra diferents epítops del antigen,
i un segon anticòs monoclonal unit a un enzim que catalitza una reacció de
coloració. La quantitat de producte es medeix per un canvi de color en un lector de
plaques de microtitulació, i és directament proporcional a la quantitat d’antigen. En
les determinacions de les sTNFRs, en els dos casos la concentració mínima
detectable és de 0.1 ng/ml. Els coeficients de variació intra-inter assaig són < 7 i <
9% respectivament. El TNF no interfereix en l’assaig i no existeixen reaccions
creuades entre sTNFR1 i sTNFR2. En el cas de la IL-6, la concentració mínima
detectable és de 2 pg/ml, els coeficients de variació intra-inter assaig són < 6 i <
8% respectivament. Les fraccions solubles de la IL-6 i les del gp130 no
interfereixen en l’assaig.
Anticòs 2
E
Substrat
Producte Colorejat
Antigen
Anticòs 1
Principi de l’EASIA
3.3.3.10. Determinació de Leptina
Es va determinar per radioimmunoassaig (RIA) seguint les recomanacions del
Kit (Linco Research, Inc. Missouri, USA). El RIA és una tècnica analítica
competitiva ja que està basada en el comportament competitiu de l’antigen i el
traçador radioactiu (antigen marcat) per unir-se al mateix anticòs, de forma que en
absència d’antigen tot el complex que es forma és radioactiu, i en augmentar la
quantitat d’antigen, aquest desplaça al traçador del complex i es forma menys
complex radioactiu. El complex es separa de la resta de la mostra i es compta la
radioactivitat. El traçador radioactiu utilitzat va ser I125 –Leptina humana . El
complex radioactiu es precipita amb polietilenglicol i es compta en un comptador
de radiacions gamma. El límit més baix de detecció és de 0.5 ng/ml. Els coeficients
69
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
intra-inter assaig són < 7 i < 8% respectivament. No presentava reacció creuada
amb la proinsulina, insulina o amb el glucagó.
Ag + Ac + Ag 
(Ag – Ac) + (Ag – Ac)
Principi del Radioimmunoassaig. Sistema d’equilibri Antigen, Anticòs i Traçador.
Ag: Antigen, Ac: Anticòs, i Ag : Traçador.
3.3.3.11. Determinació de Globulina Transportadora de Cortisol (CBG) i la
seva forma Glicosidada
La globulina transportadora de cortisol es va determinar segons el
radiimmunoassaig desenvolupat per Pugeat (Pugeat M, 1989).
Per la determinació de la forma glicosidada, mostres de sèrum van ser sotmeses
a una absorció de sefarosa ConA.
3.3.3.12. Fórmula Leucocitària i Recompte de Cèl·lules Blanques
Es van determinar per els tests de rutina del laboratori mitjançant un Coulter
Electronics (ABBOTT Diagnostic Division, Illinois, USA).
3.3.4. PARÀMETRES GENÈTICS
3.3.4.1. Extracció de l’Àcid Desoxirribonucèid (DNA)
Per a l’extracció del DNA de les cèl·lules blanques es va utilitzar el Kit
QIAamp DNA Blood Mini Kit (Quiagen, Alemanya) seguint les recomanacions del
proveïdor. El producte final resultant és DNA genòmic. El rendiment d’aquesta
tècnica és de 100-500 ng/µl.
a) Quantificació i puresa del DNA.
70
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Fonament:
Els nucleòtids en solució absorbeixen a la regió de l’espectre de la llum
ultraviolada (UV) amb un màxim d’absorció al voltant de una longitud d’ona de
260nm. Les proteïnes també ho fan a UV però més a 280nm que a 260nm.
Els àcids nucleics van ser quantificats i estimada la seva puresa per
espectofotometria, mesurant la seva absorció a 260 i a 280nm i comparant els
resultats amb els obtinguts en una solució pura, on la relació entre A260 i A280 que
ens dona la puresa de la mostra ha de ser de 1,8.
Per a calcular la concentració de DNA es parteix de la base de que una solució
amb una absorbància de 1 conté aproximadament 50 µg de DNA per ml.
Índex de puresa: A260 / A280
Concentració DNA µg/ml = A260 x 50
Un cop quantificat es conserva a 4ºC o congelat a – 20ºC.
3.3.4.2. Anàlisi de la Regió 3’ no Traduïda del Gen del TNFR2
La zona a estudiar comprén del nucleòtid 501 al
692 (NCBI. GenBank,
número d’accés:U52165) dins de la regió 3’ no traduïda del gen.
L’anàlisi d’aquesta regió es va fer utilitzant la tècnica d’anàlisi de conformació
de cadena única o SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms).
Fonament:
Desenvolupada al 1989 (Orita M, 1989) és un dels mètodes de rastreig de
mutacions més utilitzats. El principi es basa en aplicar una electroforesi a un
fragment de DNA amplificat i desnaturalitzat, en un gel no desnaturalitzant. Fer
córrer una única cadena de DNA per aquests tipus de gels permet interaccions
intramoleculars. Ja que el DNA no migra com una cadena linear en el gel de SSCP,
la mobilitat del DNA està influïda tant per la mida del fragment com per
l’estructura terciària (conformació) que ha adoptat. La conformació del fragment
71
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
de cadena única depèn de la seva seqüència nucleotídica. Si existeix una mutació,
la conformació és alterada, la mobilitat del fragment en el gel també.
Procediment:
1.- Amplificació mitjançant la Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR) del
fragment de la regió 3’ UTR que volem analitzar.
La PCR és una tècnica per a l’amplificació selectiva “in vitro” (d’una magnitud
de 106 còpies) de seqüències específiques de DNA limitades pels oligonucleòtids
cebadors. El mètode de la PCR va ser elaborat per Mullis al 1987 (Mullis K,
1987).
Es van dur a terme en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PE ABI,
Foster City, USA).
Els cebadors que es van utilitzar van ser (NCBI.Genbank, nombre d’accés:
U52165):
Seqüència cebador amb sentit: 5’ AGG ACT CTG AGG CTC TT CT 3 ’
Seqüència cebador antisentit: 5’ TCA CAG AGA GTC AGG GAC TT 3’
El volum final de reacció va ser de 50 µl i contenia:100 ng de DNA mostra, 1.2
mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM de Tris-HCl pH 8.4, 0.2 mM de cada dNTPs
(Roche Molecular Biochemicals, Germany), 1 unitat de Taq DNA polimerasa
(GibcoBRL, Carsbad, USA), i 0.2 µM de cada cebador (GibcoBRL, Carsbad,
USA).
El DNA es va amplificar durant 35 cicles amb una desnaturalització a 94ºC
durant 30 segons, acoplament de cebadors a 66ºC durant 30 segons i extensió a
72ºC, 30 segons. Finalment es sotmet a una extensió a 72ºC durant 7 minuts.
La mida del fragment amplificat és de 191 parells de bases (pb.).
2.- Visualització del fragment amplificat en un gel d’agarosa.
L’obtenció de gels d’agarosa es realitza a base de fondre la quantitat d’agarosa
desitjada (en funció de la concentració final del gel) en un tampó adequat, i fusió
de la mescla fins obtenir una solució clara i homogènia. Es deixa refredar i
s’afegeix el colorant bromur d’etidi que s’intercala entre les bases dels
72
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
nucleòtids del DNA i permet visualitzar-lo com a banda de color taronja sota la
llum ultraviolada. L’agarosa fosa es tira en un motlle de metacrilat amb una
pinta que formarà els pous on es dipositarà el DNA amplificat i es deixar
solidificar. Per la visualització directa de la situació del DNA al gel, al producte
amplificat incorporem el colorant blau de bromofenol.
Aquest tipus de gels es sotmeten a electroforesi horitzontals sota un camp
elèctric de direcció constant.
La concentració del gel per a visualitzar la banda de la regió amplificada de 191
pb. va ser a 1%. Es va mesclar 1g. d’agarosa (Gibco BRL, Carsbad, USA )amb
50 ml del tampó TBE. L’electroforesi va ser a 100 V durant 15 minuts. La banda
es va contrastar amb el marcador de mida coneguda Marker VIII (Roche
Molecular Biochemicals, Alemanya).
3.- Desnaturalització del producte amplificat.
Per a la molècula del DNA la configuració nativa és una doble hèlix i parlem
d’un estat desnaturalitzat quan passa a ser de cadena única.
A un volum de 2-4 µl de producte amplificat (segons el rendiment de la PCR) es
va afegir 20 µl de la solució desnaturalitzant que contenia: 91% de formamida i
9% de blau de bromofenol i xilencianol. Per tal de desnaturalitzar les dobles
cadenes de DNA, la mescla es calenta a 96ºC durant 10 minuts.
4.- Electroforesi en gel no desnaturalitzant de poliacrilamida (PAGE).
El poder de resolució dels gels de poliacrilamida és extremadament alt.
S’utilitzen en una configuració vertical i a un voltatge constant. Els monòmers
d’acrilamida es polimeritzen en cadenes llargues com a conseqüència d’una
reacció que s’inicia en presència de radicals lliures, aportats per el persulfat
amoni i estabilitzats per TEMED (GibcoBRL, Carsbad, USA). Quan s’incorpora
la bisacrilamida, les cadenes s’uneixen i determinen la porositat del gel.
La concentració del gel d’acrilamida va ser al 12% (acrilamida/bisacrilamida
(GibcoBRL, Carsbad, USA) en proporció 30:1). L’electroforesi va ser a 120 V
durant 17 hores i a temperatura ambient.
73
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
5.- Revelat del gel.
El revelat del gel va ser amb tinció de plata. Es va utilitzar: àcid nítric 1%
(Merck, U.S.A), solució de plata al 0.2% (Merck, U.S.A), solució de carbonat
sòdic (formaldehid 37% i carbonat sòdic 0.28M (Merk, U.S.A)), àcid acètic 10%
(Merck, U.S.A) i glicerol 10% (Merck, U.S.A) per aquest ordre citat.
Els anàlisis de SSCP van mostrar 3 patrons de bandes diferents, tal com mostra
la figura 9.
6.- Seqüenciació automàtica en capil·lar dels patrons de bandes.
La sequenciació automàtica consisteix en una PCR cíclica, on els
dideoxinucleòtids estan marcats amb quatre fluorocroms de diferent color, i en
una electroforesi en gels en fins capil·lars per on es separen els fragments segons
la seva longitud. El nucleòtid queda determinat quan el flurocrom es excitat per
un làser al final de l’electroforesi. L’anàlisi de les senyals rebudes a l’ordenador
permet establir la seqüència del fragment a estudi.
Figura 9: Patró de bandes que caracteritza a les variants A1, A2 i A3 en la regió
3’UTR del gen del TNFR2. Gel acrilamida-bisacrilamida 30:1 al 12%.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A1
A2
A3
74
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Per tal de caracteritzar les variants, es va extraure el DNA de les bandes que
formaven els patrons variables al gel amb el Kit QUIAEX II Gel extraction Kit
(Quiagen, Alemanya) seguint les recomanacions del proveïdor. El DNA es va
seqüenciar amb el Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (ABI, Foster City,
USA) i amb un seqüenciador model DRA 373A (ABI, Foster City, USA) seguint
les recomanacions del proveïdor.
La seqüenciació automàtica va revelar 3 variants genètiques, A1, A2 i A3, amb
mutacions puntuals als nucleòtids 593, 598 i 620 que es corresponien amb els 3
patrons de bandes anòmals al gel. A més a més, amb la seqüenciació es va
determinar una nova variant A4. (taula 4)
Taula 4: Variants genètiques de la regió 3’UTR del gen del TNFR2 ( 593A>G;
598T>G; 620T>C), determinades per SSCP (A1,A2 i A3) i per
seqüenciació automàtica (A4).
VARIANTS
Nucleòtid
Nucleòtid
Nucleòtid
593
598
620
A1
G
T
T
A2
A
T
C
A3
A
G
T
A4
A
T
T
3.3.4.3. Anàlisi del Polimorfisme Genètic –174 G>C del Gen de la IL-6
Es tracta d’una transversió G>C a la posició – 174, dins del promotor del gen
de la IL-6. Aquest canvi produeix un polimorfisme del tipus de fragments de
restricció de longitud polimòrfica i es va estudiar per el mètode d’anàlisi de
fragments de restricció de longitud polimòrfica (RFLP).
Fonament:
75
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Els enzims de restricció es purifiquen d’una gran varietat de bacteries.
S’uneixen específicament al DNA de doble cadena i el fraccionen (digestió del
DNA) per llocs específics o zones adjacents a una seqüència particular denominada
diana de restricció. Els fragments de diferent longitud resultants es poden analitzar
per electroforesi.
Ocasionalment les mutacions creen o destrueixen dianes de restricció al DNA
cosa que permet detectar-les per enzims de restricció.
Procediment:
1- Amplificació mitjançant la Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR) del
fragment del gen de la IL-6 que conté el polimorfisme.
Els oligonucleòtids cebadors van ser (Genbank, nombre d’accés: AF048692):
Seqüència cebador amb sentit: 5’ TGA CTT CAG CTT TAC TCT TTG T 3’
Seqüència cebador antisentit: 5’ CTG ATT GGA AAC CTT ATT AAG 3’
El volum final de reacció va ser de 50 µl i contenia:100 ng de DNA mostra, 3
mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM de Tris-HCl pH 8.4, 0.2 mM de cada dNTPs
(Roche Molecular Biochemicals, Alemanya), 2 unitats de Taq DNA polimerasa
(GibcoBRL, Carsbad, USA), i 0.2 µM de cada oligonucleotid cebador
(GibcoBRL, Carsbad, USA).
El DNA es va amplificar durant 30 cicles amb una desnaturalització a 94ºC
durant 30 segons, acoplament de cebadors a 55ºC durant 30 segons i extensió a
72ºC, 30 segons. Finalment es sotmet a una extensió de 72ºC, 7 minuts. La mida
del fragment amplificat és de 198 parells de bases.
2- Visualització del fragment amplificat en un gel d’agarosa al 2% tenyit amb
bromur d’etidi. Electroforesi a 60 V durant 15- 20 minuts. Marcador de mida
coneguda Marker VIII (Roche Molecular Biochemicals, Alemanya).
3- Digestió del fragment amplificat amb l’enzim de restricció Sfa N I (New
England BioLabs, Beverly, USA) segons les condicions recomanades per el
proveïdor.
76
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
4- Visualització dels fragments de digestió en un gel d’agarosa d’alta resolució
(permet una millor resolució de les bandes) al 2,5% i per tinció amb bromur
d’etidi. Electroforesi a 60 V durant 20 minuts.
Es va detectar un polimorfisme dial.lèlic, on la presència de la banda de 198 pb.
correspon a l’al.lel A1 o C (absència de diana de restricció) i la de les bandes de
140 i 58 pb. a l’al.lel A2 o G (presència de la diana de restricció). Les bandes es
van contrastar amb el marcador de mida coneguda Marker VIII (figura 10).
Figura 10: Polimorfisme –174G>C del gen de la IL-6. Gel d’agarosa al 2,5%
1: Marcador de mida molecular, 2-10: Mostres
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
G/C C/C G/G
198 pb
140 pb
77
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
3.4. TRACTAMENT ESTADÍSTIC DE LES DADES.
L’anàlisi estadístic es va realitzar utilitzant dels paquets estadístic BMDP
(BioMedical Package) i SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) (versió 6.0).
PROVES ESTADÍSTIQUES REALITZADES.
- Proves d’ajust a la corba de Gauss de totes les variables: prova de Shapiro-Wilks. Les
variables que no es distribueixen de forma Gausiana, es transformen logarítmicament per
tal d’adquirir la normalitat.
- Estadística descriptiva. Mitjana i Desviació estándar per a les variables quantitatives.
- Prova “t” d’Student-Fisher (prèvia comprovació de la homogeneïtat de les variances
mitjançant la prova “F” de Fisher-Snedecor) per la comparació de mitjanes de variables
quantitatives amb dos categories.
- Prova de Ji-quadrat amb la correcció de Yates (quan va ser necessari) o prova exacta de
Fisher, per a la comparació de variables qualitatives.
- Anàlisi unidireccional de la variança (comprovant primer l’homogeneïtat de les variances
mitjançant la prova “F” de Fisher-Snedecor), per a l’estudi de comparacions de mitjanes
de dos variables quantitatives amb més de dos categories.
- Anàlisi de correlació. Coeficients de correlació de Pearson.
- Regressió lineal múltiple per a variables dependents quantitatives i independents
qualitatives o quantitatives. Mètode Stepwise. El coeficient de regressió generat per
aquest anàlisi indica la pendent de l’associació entre la variable dependent i la
independent especificada, després d’ajustar per altres variables independents del model.
78
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
MATERIALS I MÈTODES
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
El model R2 representa el percentatge de variació de la variable dependent que s’explica
per les variables independents incloses en el model.
- Anàlisi de regressió logística. Per a l’estudi de variables dependents qualitatives on
participen varies variables independents.
- Càlcul de les freqüències gèniques i al·lèliques de les poblacions. Acceptant el model
d’herència mendeliana dels RFLP’s la combinació dels al·lels que pertanyen a un locus es
regeix per la llei d’equilibri de poblacions o llei de Hardy-Weinberg (Hardy GH, 1908).
Aquesta llei estableix que, en absència de factors externs, la freqüència dels al·lels ha de
ser constant a través de les generacions. Així, la població en estudi es divideix en dos
grups: aquells individus que presenten el marcador considerat (freqüència = p) i els que
no el presenten (freqüència =(1-p) o q. De la combinació al·leatoria de dos al·lels, A i a
(no A), amb freqüències al·lèliques p i q respectivament, i en les condicions d’equilibri
poblacional, resultarien 3 genotips AA, aa i Aa de freqüències p2, q2 i 2pq respectivament.
Es compleix que p2 +2pq + q2 = 1.
79
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
4. PUBLICACIONS
80
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ESTUDI 1.
PLASMA LEVELS OF THE SOLUBLE FRACTION OF TUMOR NECROSIS
FACTOR RECEPTOR 2 AND INSULIN RESISTANCE. Diabetes 47:1757-62, 1998.
81
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
82
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
83
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
84
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
85
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
86
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
87
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
88
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ESTUDI 2.
POLYMORHISM OF THE TUMOR NECROSIS FACTOR- RECEPTOR 2 GENE
IS
ASSOCIATED
WITH
OBESITY,
LEPTIN
LEVELS,
AND
INSULIN
RESISTANCE IN YOUNG SUBJECTS ANS DIET-TREATED TYPE 2 DIABETIC
PATIENTS. Diabetes Care 23:831-37, 2000.
89
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
90
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
91
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
92
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
93
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
94
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
95
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
96
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ESTUDI 3.
INTERLEUKIN-6 GENE POLYMORPHISM AND INSULIN SENSITIVITY.
Diabetes 49:517-20, 2000.
97
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
98
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
99
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
100
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
101
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ESTUDI 4.
INTERLEKIN-6 GENE POLYMORPHISM AND LIPID ABNORMALITIES IN
HEALTHY SUBJECTS. J Clin Endocrinol Metab 85:1334-39, 2000.
102
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
103
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
104
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
105
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
106
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
107
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
PUBLICACIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
108
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
5. DISCUSSIÓ
109
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
5.1. ESTUDI 1
PLASMA LEVELS OF THE SOLUBLE FRACTION OF TUMOR NECROSIS
FACTOR RECEPTOR 2 AND INSULIN RESISTANCE. Diabetes 47:1757-1762,
1998.
En aquest primer treball s’estudia el paper que desenvolupa el sistema TNF per
mitjà dels seus receptors de membrana en la resistència a la insulina estudiada “in vivo”, en
una població amb un grau d’obesitat moderada. La base d’aquest estudi es fonamenta en
un treball previ del grup d’Hotamisligil GS, ja comentat a la introducció (Hotamisligil GS,
1997). En aquest treball es demostrava que l’expressió dels dos receptors de membrana del
TNF (TNFR1 i TNFR2) es trobava clarament diferenciada en relació amb el teixit adipós.
Així, els nivells de mRNA de TNFR2 eren molt més abundants en el teixit adipós de dones
amb un grau d’obesitat severa, i aquesta expressió es correlacionava fortament amb els
nivells plasmàtics de la fracció soluble del mateix receptor (sTNFR2). En aquest sentit, el
nostre treball va mostrar resultats coherents en aquesta línia, els individus obesos
presentaven nivells d’sTNFR2 més alts que els no obesos, a diferència dels sTNFR1, que
eren similars. A més a més, vàrem constatar una clara correlació entre els nivells
plasmàtics del receptor 2 (sTNFR2) i la resistència a la insulina (r= 0.38, p=0.02),
analitzada per mitjà del test de tolerància intravenosa a la glucosa amb mostreig freqüent
(test del model mínim) (figura 3).
Un altre aspecte interessant que vàrem poder confirmar en el nostre treball va ser la
intensa relació que hi ha entre els nivells plasmàtics del receptor 2 del TNF amb el sexe i
el grau d’obesitat de la població estudiada. L’estudi global entre homes i dones, va
permetre observar uns nivells superiors d’ambdues fraccions solubles de receptors en el
grup dels homes. En distribuir els subjectes segons la presència /absència d’obesitat, vàrem
poder constatar una major resistència a la insulina en els homes, junt amb uns nivells
d’sTNFR2 més elevats respecte a les seves homòlogues de sexe contrari. Aquestes
diferències, en canvi, no es van observar en els nivells plasmàtics d’sTNFR1.
És obvi que la composició corporal dels dos sexes és clarament diferent i que
podria intervenir en les troballes comentades, sobretot si tenim en compte la diferent
expressió al teixit adipós de TNFR2 respecte TNFR1 comentada anteriorment. En aquest
110
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
sentit van poder constatar una relació directa entre els nivells d’sTNFR2 i dos marcadors
de la composició corporal com són el BMI i la WHR. De fet, aquesta relació amb la WHR
ja havia estat descrita en l’estudi d’Hotamisligil en població amb obesitat severa
(Hotamisligil GS, 1997). És conegut que aquests dos paràmetres són predictors
independents de la sensibilitat a la insulina, i especialment, la raó cintura maluc, que
proporciona una mesura de l’obesitat d’origen abdominal. Aquest tipus d’obesitat, també
anomenada obesitat central o intra-abdominal, presenta una elevada correlació amb el risc
cardiovascular i amb l’aparició de la DM2, a causa de, fonamentalment, la seva associació
amb la resistència a la insulina (Lemiuez S, 1996) i (Kissebah AH 1994).
En els subjectes del nostre treball, les sTNFR2 es correlacionen també amb la
glicèmia basal i la glicèmia després de la sobrecàrrega oral de glucosa, cosa que suggereix
que aquest receptor podria estar regulat en l’obesitat per uns mecanismes de senyals
comuns amb la glucosa. De fet, treballs previs ja van donar a conèixer que l’expressió del
TNF era directament dependent dels nivells d’hiperinsulinèmia (Hotamisligil GS, 1995),
així com de la disponibilitat perifèrica de glucosa determinada pel clamp euglucèmic
(Saghizadeh M, 1996). Això suposaria que l’activitat major del TNF observada en
situacions de RI, com pot ser l’obesitat i la pròpia DM2 s’acompanyaria d’una síntesi
major per part del teixit adipós de les seves fraccions solubles; això contribuiria a una més
gran resistència a la insulina, com sembla que indiquen els resultats dels nostre treball,
sobretot en relació amb el TNFR2. Ja era conegut el fet que l’expressió del TNFR2 es trobi
associada a un major grau d’adipositat abdominal (Hotamisligil GS, 1997), la qual
s’associa per si mateixa a una major RI. En canvi, nosaltres vàrem poder constatar que de
forma independent els nivells d’sTNFR2 eren capaços de predir el grau de RI, fet que el
confereix un valor intrínsic en aquest procés.
El fet d’atribuir a les sTNFR una acció potenciadora de l’activitat del TNF sobre
el teixit adipós no deixa de ser un procés especulatiu. Sabem que aquestes fraccions poden
actuar de forma diferent en circumstàncies determinades, potenciant l’acció del TNF o bé
tamponant la seva acció en actuar sobre el receptor de membrana i disminuint o inhibint
així la seva acció (Aderka D, 1992). Intentar discernir si es tracta d’un efecte amplificador
de la resposta del TNF sobre l’adipòcit, o d’un intent de compensar la disfunció
111
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
provocada per l’increment en la transcripció del TNF en aquest tipus cel.lular , és difícil
de realitzar amb les dades disponibles.
En relació amb les diferències amb la composició corporal d’ambdós sexes, un altre
aspecte interessant observat en el nostre treball, va ser la constatació que els homes que
presentaven els nivells de les fraccions solubles més elevats d’ambdós receptors
presentaven, així mateix, una menor proporció de teixit adipós amb una major massa
muscular (FFM). És conegut que el teixit muscular és un dels òrgans diana més importants
d’acció de la insulina, i alhora amb capacitat per sintetitzar el TNF (Saghizadeh M,
1996). La presència d’una major massa muscular, associada a una més gran RI i a uns
nivells d’sTNFR2 més alts en els homes, fa pensar en una font accessòria d’sTNFR2
d’origen muscular. Hipotèticament, aquest nivells més elevats d’sTNFR2 provinents del
teixit muscular podrien intervenir en l’estabilitat de la forma activa del TNF (homotrímer
de TNF), i donar lloc a una prolongació del seus efectes en la cèl·lula adiposa.
Evidentment aquesta hipòtesi hauria de ser confirmada mitjançant estudis “in vivo” sobre
el teixit muscular, per comprobar una major expressió d’sTNFR2 i el seu efecte sobre
l’activitat del TNF. Són pocs els treballs realitzats en aquest teixit en relació amb
l’expressió de TNFR1 i 2; no obstant això, recentment en un grup de pacients amb
patologia associada a RI com són els pacients amb HIV amb lipodistròfia els quals han
perdut la major part del teixit adipós, es va poder constatar un clar increment d’sTNFR2,
altament correlacionat amb la sensibilitat a la insulina de predomini muscular, determinada
per mitjà de la tècnica del clamp euglucèmic (Mynarcik DC, 2000). Òbviament existeix la
possibilitat de la participació d’un component inflamatori responsable de la hiperactivitat
del sistema TNF en aquests pacients, però podria tractar-se d’una font d’sTNFR2 de
predomini muscular, cosa que donaria suport a la hipòtesi anteriorment comentada.
En resum, en aquest treball descrivim per primer cop una relació entre l’acció de la
insulina i els nivells circulants de les fraccions solubles del receptor 2 del TNF.
Presentem les sTNFR2 com a possibles marcadors de resistència a la insulina mediada per
TNF en l’estat d’obesitat. Com ja hem comentat en la introducció d’aquesta tesi, la
mesura dels nivells circulants en TNF és extremadament difícil i poc informativa a causa
112
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
dels nivells baixos i les interferències amb altres proteïnes. En canvi, els nivells d’sTNFRs
són més elevats en l’obesitat, són proteïnes més estables i fácils de mesurar.
113
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
5.2. ESTUDI 2
POLYMORPHISM OF THE TUMOR NECROSIS FACTOR- RECEPTOR 2
GENE IS ASSOCIATED WITH OBESITY, LEPTIN LEVELS, AND INSULIN
RESISTANCE IN YOUNG SUBJECTS AND DIET-TREATED TYPE 2 DIABETIC
PATIENTS. Diabetis Care 23(6):831-37, 2000.
Les evidències cada cop més grans de la participació del sistema TNF en el
desenvolupament de la resistència a la insulina, i més concretament en el paper determinat
que semblaben tenir els receptors d’aquesta citocina, sobretot els nivells de les fraccions
solubles del TNFR2, tal com ja s’ha comentat en el treball anterior, ens va motivar a seguir
estudiant el paper del sistema del TNF, especialment vinculada al receptor 2 de la
citocina. Fins aquest moment, sabiam que l’anomenat sistema TNF mantenia una clara
autoregulació, per mitjà del que podriam denominar “feed-back” ultracurt, on intervenia un
efector (el TNF), dos receptors (R1 i R2) i diversos moduladors entre els que destacaben
les fraccions solubles d’ambdós receptors. No obstant això, diversos treballs a finals dels
anys 90, van implicar en la complexa red d’activitat del sistema TNF a una nova
hormona, la leptina, sintetitzada principalment per el teixit adipós. Diversos treballs havien
conseguit demostrar que tant a nivell d’experimentació animal “in vivo” com en cultius
d’adipocits, el TNF era capaç d’estimular la secreció de leptina i alhora, la pròpia leptina
era capaç d’autoregular l’expressió del TNF (Grunfeld C, 1996) i (Kirchgessner TG,
1997). Alhora, era conegut que els nivells de leptina en humans circulaben en estreta
correlació tant amb els nivells circulants del TNF (Zumbach MS, 1997) com amb els de
les fraccions solubles dels seus receptors (Mantzoros CS, 1997). Tot això va portar a la
hipòtesi de l’existència de l’anomenat
“eix leptina-TNF”, especulant sobre la seva
possible relació amb el desenvolupament de resistència a la insulina i l’obesitat.
Aquesta nova prespectiva va fer que el nostre grup es plantegés l’estudi de la
relació entre aquestes adipoquines des del punt de vista serològic i genètic, sota la hipòtesi
ja comentada anteriorment, d’un possible paper regulador del gen del TNFR2 sobre l’eix
TNF-leptina. L’abordatge tècnic per analitzar el gen del TNFR2 en la seva totalitat era
114
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
complicat i per això en aquesta primera aproximació a l’estudi de possibles mutacions en
aquest gen, ens vàrem proposar avaluar una regió on previament un grup havia descrit
l’existència de variacions en la seqüència que podien ser importants en l’estabilitat del
mRNA i que es trobaba situada en l’extrem 3’ del gen, en la regió no traduïda (3’UTR)
(Kaufman BA, 1993).
La descripció previa de les variacions descrites en aquesta regió per Kaufman BA
es mostraba confusa en alguns aspectes ja que no hi havia una definició clara de les bases
mutades responsables de les diferents variants descrites. Aquest estudi s’havia realitzat per
la tècnica denominada SSCP. Aquesta tècnica es basa en la diferent mobilitat
electroforètica del DNA de cadena única, cosa que permet una ràpid rastreig de possibles
mutacions que variin aquesta mobilitat. No obstant això, aquesta tècnica no ofereix
informació sobre la mutació que existeix, només serveix per identificar de forma
qualitativa la seva possible existència. En el nostre cas, es van observar 3 patrons de
bandes diferents, que després de la seva seqüenciació, es varen assignar a quatre variants
al·lèliques anomenades A1-A4. En totes elles, variacions en tres nucleòtids en les posicions
593, 598 i 620 determinaben les quatre variants nombrades. Les variants A3 i A4
presentaben la mateixa mobilitat electroforètica i només es van diferenciar per
seqüenciació directa.
En l’estudi per genotips extesos vàrem observar una tendència entre els homozigots
per l’al·lel A2 a presentar nivells circulants de leptina més alts i un BMI major. La baixa
freqüència dels al·lels A3 i A4, i per tal de facilitar l’estudi, vàrem decidir agrupar-los amb
l’al·lel A1 en un mateix grup, anomenat al texte grup no-A2 (absència de l’al·lel A2). La
resta el formaben els portadors de l’al·lel A2. La distribució genotípica i al·lèlica de la
població sana no va mostrar diferències significatives respecte a les observades entre els
pacients amb DM2 (taula1).
Un altre cop, en aquest estudi vàrem poder constatar un clar efecte del sexe i l’edat
sobre els resultats obtinguts. Així els individus més joves (edat inferior a la mitjana global
del grup) mostraben un BMI i uns nivells circulants de leptina significativament més alts
entre els portadors de l’al·lel A2, respecte als no-A2. Aquestes diferències eren a més a
més degudes a les dones portadores d’aquest al·lel. Aquest resultats eren també
reproduibles en la població amb DM2, però, només entre els pacients que no rebien
115
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
fàrmacs hipoglucemiants o insulina pel tractament de la diabetis (figura1). Pensem que les
possibles diferències existents i que no observem en aquest subgrup d’individus tractats
amb hipoglucemiants podrien haver quedat emmascarades pel pròpi tractament amb els
hipoglucemiants, o bé per l’hiperinsulinisme ja sigui per l’exògen, induit per la insulina
subcutània o bé pel produit per l’estimul sobre la cèl·lula beta pancreàtica dels
hipoglucemiants orals. Així doncs, a la nostra població motiu d’estudi, la variants A2 del
gen del receptor 2 del TNF sembla influir en la regulació de l’adipocitat i els nivells
circulants de leptina, tant en els individus sans com en pacients amb DM2.
Davant aquesta observació, cabria esperar de forma lògica una major prevalència de
l’al·lel A2 entre els subjectes amb DM2, que com sabem presenten un major BMI i nivells
més elevats de leptina que la població sana (Moller N, 1998) i (Paolisso G, 1998). No
obstant això, no vàrem poder constatar aquest esperat augment de la freqüència de l’al·lel
A2. És difícil trobar una única i convenient explicació per aquesta observació. Hem de
tenir en compte, però, que la diabetis tipus 2 és una malaltia heterogènia amb múltiples
factors que poden afectar de manera diversa a les variables que estudiem, molt difícils de
controlar amb el tipus de disseny d’aquest estudi. La presència d’obesitat, els diferents
tractaments utilitzats, la coexistència d’altres malaties derivades de la pròpia diabetis, el
temps d’evolució de la diabetis, etc, són factors que només des d’un estudi prospectiu
poden ser controlats correctament.
La troballa d’una associació entre els nivells de leptina circulants, el grau d’obesitat
i aquesta regió genètica, ens fa intentar buscar una base fisiopatològica que intenti explicar
les observacions descrites. La participació de la regió no traduïda del gen en el
processament correcte del mRNA, podria conferir a les variants observades una eficiència
diferent en el procés. No obstant això, aquesta hipòtesi no deixa de ser una expeculació no
demostrable amb les dades disponibles d’aquest treball, i es necessiten d’estudis “in vitro”
que determinin la variació en la transcripció i estabilitat del mRNA en diferents grups
cel·lulars. Un altra possible explicació a l’associació observada, seria l’existència de
marcadors genètics situats a prop del locus del gen del TNFR2 i que es trobessin en
desequilibri de lligament. En aquest sentit, alguns treballs sobre marcadors genètics
susceptibles a conferir obesitat, realitzats en cohorts de famílies, suggerixen “zones
calentes” situades des de la regió 1p32 fins a la 1p22 lligades a major BMI, massa grassa i
116
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
insulinèmia basal (Chagnon YC, 1997 i 1998). Com es recordarà, esta zona es troba aprop
d’on s’ubica el gen del TNFR2 i per tant podria tractar-se d’un marcador d’altres locus
susceptibles lligats al gen del TNFR2.
Com recordarem les dades del nostre treball demostren que els portadors de l’al·lel
A2 presentaben un major BMI amb major percentatge de massa grassa i nivells circulants
més elevats de leptina. Aquesta associació era observada preferenment als individus més
joves i fundamentalment en les dones, perdent-se en el grup d’individus de major edat.
L’edat és un factor determinat en el manteniment de la regulació de “l’eix leptina-TNF”
(Qian H, 1998), i sabem que entre la població d’edat avançada la pèrdua de la relació entre
la grassa corporal i la leptina, es tradueix en un major BMI i una menor pèrdua de pes
(Moller N, 1998). La nostra hipòtesi, sobre la base de les observacions d’aquest estudi
implicaria als subjectes portadors de l’al·lel A2 sobre una possible desregulació del sistema
nombrat, afavorint una major activitat del sistema TNF a nivell paracrí, amb el
subsegüent increment de massa grassa i nivells de leptina. El fet de no trobar diferències en
els nivells circulants de les fraccions solubles de TNFR2 segons el genotip que hem
estudiat, no descarta que de forma subclínica aquesta citocina es pugui trobar de forma
desproporcionadament elevada a nivell tissular, amb les conseqüents anomalies
metabòliques. Obviament, no podem descartar altres factors de confusió com l’edat, el
temps d’evolució de la diabetis, complicacions associades a la diabetes, etc, que puguessin
afectar als nivells circulants d’aquests receptors.
Un altre aspecte interessant d’aquest treball, és l’associació observada entre l’al·lel
A2 i característiques fenotípiques de la síndrome metabòlica associada a resistència a la
insulina. La presència d’un índex cintura-maluc més alt, nivells circulants d’insulina més
alts i major resistència a la insulina junt amb l’observació d’hipertrigliceridèmia als
individus portadors de l’al·lel A2, dóna suport a la participació d’aquest loci genètic a
conferir susceptibilitat per al desenvolupament de la síndrome metabòlica. És difícil no
obstant, determinar si la resistència a la insulina que presenten els individus portadors de
l’al·lel A2 és una causa del fet de ser portador d’aquest al·lel, o bé està traduint una
conseqüència d’un ambient amb majors nivells de leptina i major BMI. La leptina, és una
hormona amb capacitat de millorar la sensibilitat a la insulina, tal com ja s’ha demostrat en
models d’animals i més recentment en un brillant estudi realitzat en pacients amb diversos
117
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
tipus de lipodistròfia, en els quals l’administració d’aquesta hormona aconseguia millorar
les alteracions metabòliques lligades a la síndrome metabòlica que presentaben aquest
pacients, reduint de forma important la resistència a la insulina d’aquests pacients. Aquests
canvis s’acompanyaben d’una reducció dels nivells de TNF en plasma, cosa que
confirmaba l’importància reguladora de “l’eix leptina-TNF” “in vivo” als humans (Oral
EA, 2002).
Així doncs, en aquest treball identifiquem la presència de l’al·lel A2 en la regió
3’UTR del gen del TNFR2 que podria predisposar presentar BMI i nivells de leptina més
alts així com una menor sensibilitat a la insulina; i per tant confereix al gen del TNFR2 un
possible paper en la base genètica de la resistència a la insulina.
118
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
5.3. ESTUDI 3
INTERLEUKIN-6 GENE POLYMORPHISM AND INSULIN SENSITIVITY.
Diabetes 49:517-20, 2000.
Seguint amb la nostra línia d’investigació sobre citocines proinflamatòries, el
nostre grup va ampliar l’estudi d’aquestes hormones a una nova citocina implicada també
en la resposta inflamatòria: la IL-6. Així de forma quasi simultània es va estudiar la IL-6,
tal com ho havíem fet amb el sistema TNF, tant a nivell serològic com genètic, en relació
amb la seva participació en el metabolisme de la glucosa i en el lipídic. En aquest treball es
va avaluar el paper d’una variant genètica situada en la posició – 174G>C en el promotor
del gen de la IL-6 sobre la sensibilitat a la insulina en una població sana d’origen caucàsic i
mediterrani.
La IL-6, tal com ja s’ha comentat més àmpliament a la introducció, participa en la
regulació de la resposta immunològica, en reaccions de fase aguda i en l’hematopoiesi. Els
nivells d’aquesta citocina semblen que mantenen una estreta relació amb el metabolisme
glucídic, i els seus valors en el fluid intersticial del teixit adipós subcutani durant l’estat
pospandrial s’han descrit elevats, paral·lelament amb els nivells circulants de glucosa i
insulina (Orban Z, 1999). D’altra banda, en estudis amb pacients amb DM2, més
concretament amb individus amb components de la síndrome X metabòlica, s’han observat
nivells d’IL-6 circulants clarament més elevats (PicKup JC, 1997, i 1998)
La variant genètica estudiada en aquest treball havia mostrat en diversos treballs “in
vitro” previs una capacitat de modificar la taxa de transcripció del gen de la IL-6.
Concretament, els portadors en homozigosi de l’al·lel C eren els que mostraven uns nivells
plasmàtics més baixos de la citocina en plasma respecte a la resta de combinacions
genètiques (Fishman D, 1998). Així, la relació directa observada entre aquesta variant
genètica i els nivells plasmàtics d’IL-6 i la participació d’aquesta citocina en els estats en
què predomina la resistència a la insulina, com la DM2, ens va fer plantejar la hipòtesi que
aquesta mutació podria intervenir en la regulació de la resistència a la insulina en població
sana.
119
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
En la mostra analitzada vàrem poder observar un 35% d’individus homozigots per
a l’al·lel C, al·lel associat amb els nivells circulants d’IL-6 més baixos. Ja que la mostra
analitzada total era petita (n= 32), en l’anàlisi de les variables avaluades en aquest estudi,
es van definir dos grups de subjectes tenint en compte la presència o absència genotípica
de l’al·lel G. D’aquesta manera aconseguíem agrupar els individus amb menor capacitat
teòrica de síntesi d’IL-6 (homozigots CC) i la resta d’individus (GG i GC). En aquest sentit
vàrem poder observar que els individus homozigots per a l’al·lel C, mostraven nivells
d’insulina basal més baixos amb un índex de sensibilitat a la insulina superior a la resta
dels individus portadors de l’al·lel G. Així mateix, l’àrea de glucosa sota la corba després
d’un test de OGTT,
així com els nivells d’hemoglobina glicosidada, van ser
significativament més baixos en aquests individus, tot i que presentaven una edat, un BMI i
un percentatge de massa grassa similars a la resta dels individus avaluats (taula 1).
En aquest treball no disposem de la determinació directa dels nivells de la IL-6; no
obstant això, es va intentar avaluar la seva acció per mitjà de mecanismes indirectes sobre
els quals es coneix bé l’acció d’aquesta citocina. Així per exemple, es va observar que en
la nostra població els individus amb menor activitat teòrica d’IL-6 mostraven un menor
nombre de cèl·lules blanques perifèriques, així com nivells de globulina transportadora de
cortisol glicosidada més baixos que els individus portadors de l’al·lel G. Recentment, en
uns darrers estudis, el comptatge de les cèl·lules blanques ha estat relacionat amb la
sensibilitat a la insulina. En particular, en un treball de Facchini F, aquesta variable es
correlacionava significativament amb la disposició de glucosa regulada per insulina en la
pràctica del clamp euglucèmic (Facchini F, 1992). En un treball posterior demostren que el
comptatge de neutròfils i limfòcits es correlaciona positivament amb alguns components
de la síndrome de resistència a la insulina i que les concentracions plasmàtiques d’insulina
s’associaven específicament amb les dels limfòcits i monòcits (Targher G, 1996). Aquestes
associacions també es confirmen al nostre estudi, on observem una correlació significativa
entre la sensibilitat a la insulina i el comptatge de cèl·lules blanques (r= -0.48, p=0.001), el
comptatge de neutròfils (r= - 0.50, p= 0.001) i el comptatge de limfòcits (r= -0.34, p=
0.02).
Ja que la IL-6 intervé la inducció de canvis postranscripcionals en la glicosidació
de les proteïnes de fase aguda per mitjà de la unió d’un oligosacàrid (Van Dijk W, 1995),
120
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
també es va utilitzar la determinació dels nivells de la proteïna transportadora de cortisol i
de la seva forma glicosidada com a marcadors indirectes de l’acció de la IL-6. En aquest
cas, en el nostre treball els nivells d’aquesta proteïna, tant en la seva forma basal com
glicosidada, tendien a ser més alts en el grup dels individus portadors de l’al·lel G
comparats amb els no portadors d’aquest al·lel.
Entenem que es tracta d’evidències indirectes d’una suposada acció de la IL-6 ja
que, com ja hem comentat, no es van determinar els nivells circulants d’aquesta citocina.
No obstant això, hem de tenir en compte que la determinació directa dels nivells d’IL-6
tampoc ofereix un valor real de l’activitat d’aquesta citocina. La seva curta vida mitjana
plasmàtica i la seva forma de circulació unida a altres proteïnes, així com al seu propi
receptor, fa que els immunoassaigs habituals que hi ha per a la seva determinació no
reflecteixin realment l’activitat de la citocina.
Aquests resultats fan pensar en la possibilitat que el polimorfisme –174 de la IL-6,
mitjançant la seva diferent taxa de transcripció associada, pugui participar en la
predisposició genètica en el desenvolupament de la resistència a la insulina. En la nostra
hipòtesi proposada, els individus portadors de l’al·lel G, com a conseqüència de taxes de
transcripció del gen més altes, presenten nivells circulants més alts d’IL-6, cosa que és
reflecteix en els nivells més alts dels marcadors indirectes de l’acció d’aquesta citocina que
hem mesurat. Aquest grup d’individus, per diversos mecanismes encara no aclarits,
prodrien presentar predisposició a incrementar els nivells de glucosa i els d’insulina, així
com a incrementar marcadors de resposta de fase aguda i a presentar una menor sensibilitat
a la insulina.
Els mecanismes pels quals la IL-6 podria induir al desenvolupament de la
resistència a la insulina no són coneguts, i són difícils de deduir amb les dades d’aquest
treball. La IL-6 és la principal citocina en la regulació de la síntesi de proteïnes de resposta
de fase aguda, les quals segons s’ha descrit que es troben augmentades en els pacients amb
DM2, sobre tot en aquells amb característiques de la síndrome de resistència a la insulina
(Pickup JC, 1997 i 1998), (Jonsson A, 1976), (McMillan DE, 1989), com ja hem comentat.
Algunes d’aquestes proteïnes són conegudes inductores de resistència a la insulina, com és
el cas del cortisol. De fet, nivells elevats d’aquesta proteïna s’han descrit en pacients amb
DM2 amb el síndrome de resistència a la insulina (PicKup JC, 1997). La interacció d’unes
121
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
citocines amb les altres amb la forma d’activació típica en cascada, amb mecanismes de
regulació per mitjà de “feed-back” curts entre elles mateixes, fa difícil atribuir directament
a la IL-6 la seva acció sobre la resistència a la insulina. Per això hi ha la possibilitat que les
associacions observades no tinguin una relació directa amb la IL-6 i siguin un reflex de
l’acció d’una altra citocina que es trobi més directament implicada en el metabolisme de la
glucosa i en la sensibilitat a la insulina, i que alhora intervingui en l’acció de la IL-6 com
ho podria fer el TNF.
En resum, en aquest treball descrivim que el polimorfisme –174G>C en el gen de la
IL-6 pot influir en la predisposició genètica al grau de resistència a la insulina, ja que
podria intervenir sobre els nivells circulants d’insulina i de glucosa i sobre els nivells de
proteïnes de reacció de fase aguda.
122
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
5.4. ESTUDI 4
INTERLEUKIN-6 GENE POLYMORPHISM AND LIPID ABNORMALITIES IN
HEALTHY SUBJECTS. J Clin Endocrinol Metab 85(3):1334-39,2000.
Paral·lelament al nostre treball anterior, que semblava que implicava la IL-6 en la
participació en el procés de la sensibilitat a la insulina per mitjà dels seus possibles efectes
sobre el metabolisme de la glucosa, diversos treballs també apuntaven sobre la hipotètica
participació d’aquesta citocina sobre el metabolisme lipídic. Així doncs, alguns autors
atribuïen a la IL-6 un paper clau com a responsable de les anormalitats lipídiques que
presenten els individus amb la síndrome de resistència a la insulina (PicKup JC, 1997). Tal
com hem descrit extensament a la introducció aquesta hipòtesi es basava en el fet que certs
marcadors de resposta de fase aguda, la síntesi dels quals és regulada principalment per la
IL-6, augmenten en la circulació paral·lelament a la dislipèmia típica que presenten els
pacients amb aquesta síndrome. A més a més, la IL-6 s’havia vist implicada de forma
directa sobre el metabolisme dels lípids en la modulació de l’activitat de l’enzim
lipoproteïna lipasa (Greenberg AS, 1992) i de forma indirecta per l’augment de la secreció
hepàtica de triglicèrids (Nonogaki K, 1995) i l’augment en circulació dels àcids grassos.
Tenint en compte aquest possible paper fisiopatològic de la IL-6 en el metabolisme
lipídic, en el nostre grup d’investigació va decidir continuar analitzant el polimorfisme –
174G>C. Com ja hem comentat en la introducció, aquest polimorfisme estava associat a
diferents taxes de transcripció del gen de la citocina. La finalitat de les nostres
investigacions era analitzar, en una població sana d’origen mediterrani, si aquest
polimorfisme contribuïa genèticament a alterar els nivells circulants dels lípids.
Els resultats d’aquest treball indiquen que els individus portadors de l’al·lel G
s’associen a nivells circulants més elevats d’àcids grassos lliures, tant en dejú com en estat
postprandrial. També aquests individus presenten nivells més elevats de triglicèrids totals i
de fraccions de VLDL. Pel que fa a la resta de paràmetres lipídics, hi havia una tendència a
presentar els nivells d’HDLc més baixos i cap diferència amb les determinacions de les
LDLc i VLDLc (taula 1). Aquest polimorfisme havia estat descrit com la causa
d’alteracions en la transcripció del gen com a resposta a estímuls com l’endotoxina i la IL-
123
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
1. Concretament, “in vitro” els vectors portadors de l’al·lel G mostraven elevades taxes de
transcripció del gen en comparació amb els portadors de l’al·lel C, i “in vivo” s’havia
observat que els nivells circulants d’IL-6 són més alts en els individus portadors de l’al·lel
G (Fishman D, 1998). En aquest sentit, els resultats del nostre treball donen suport a
aquestes observacions, ja que els individus portadors de l’al·lel G mostren una tendència
cap als nivells circulants d’IL-6 més elevats (taula1). De fet, els sis individus amb els
nivells d’IL-6 més alts són tots portadors de l’al·lel G. No obstant això, el fet que s’observi
entre els portadors en aquest darrer resultat una tendència i no unes diferències clarament
significatives (p=0.09) ens fa pensar en una determinació d’aquesta citocina poc sensible.
Igual que el TNF, la IL-6 és una molècula molt làbil, que circula unida a fraccions
solubles de receptors o a diverses proteïnes transportadores, algunes de les quals no són
determinades pels immunoassaigs més usuals.
Els resultats d’aquest treball entre els nivells de la IL-6 i les relacions amb els
paràmetres lipídics donen suport a les troballes descrites per diversos autors. Així, en
població sana, s’han descrit valors de nivells més alts d’IL-6 associats a nivells alts de
triglicèrids juntament amb baixes concentracions de nivells d’HDL (Baggio G, 1998), i en
estudis epidemiològics amb individus amb diferents factors de risc cardiovascular, també
nivells més alts d’IL-6 s’associen a altes concentracions de triglicèrids (Mendall MA,
1997). Junt amb les nostres troballes, podríem donar suport a la hipòtesi que aquells
individus amb predisposició genètica per una elevada secreció d’IL-6 (els portadors de
l’al·lel G) també estan predisposats a presentar els nivells circulants més alts de triglicèrids
totals, VLDLtgl i àcids grassos lliures, així com els nivells més baixos d’HDLc en
comparació amb els individus portadors de l’al·lel C.
D’altra banda, el perfil lipídic associat als nivells circulants més elevats de la IL-6
que es descriu en aquest treball (augment de triglicèrids i VLDLtgl, i disminució d’HDLc)
és extensament conegut com un fenotip associat a malaltia cardiovascular a causa de les
propietats aterogèniques d’aquestes lipoproteïnes. A part de la contribució de la IL-6 en
l’aterogènesi mitjançant la inducció de molècules d’adhesió i l’augment de la
permeabilitat, els resultats descrits anteriorment fan pensar en la possible implicació
d’aquesta citocina en el procés aterògenic també per mitjà de la seva contribució a aquest
estat de dislipèmia esmentat.
124
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
DISCUSSIÓ
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Amb les dades d’aquest treball és difícil donar una explicació per mitjà de possibles
mecanismes moleculars pels quals la IL-6 pot influir en les anormalitats lipídiques
observades. Alguns dels efectes que podriem suposar sorgeixen de la seva acció sobre els
nivells dels àcids grassos lliures derivats d’estudis en animals d’experimentació. Així,
l’efecte d’aquesta citocina sobre aquest paràmetre podria ser causat per la seva acció sobre
l’activitat de la lipoproteïna lipasa del teixit adipós (Greenberg AS, 1992) o sobre la
secreció dels triglicèrids hepàtics (Nonogaki K, 1995), dos llocs clau en la regulació dels
nivells d’àcids grassos lliures circulants. També hi ha la possibilitat que els increments en
la secreció de la IL-6 observats siguin el reflex de les accions d’altres citocines que es
trobin d’una forma més propera involucrades en el metabolisme lipídic, o que la tipíca
acció de les citocines en cascada pugi afectar l’acció de la IL-6. Una citocina que presenta
les dues propietats és el TNF. Tot i que, a diferència de la IL-6, no s’han descrit
polimorfismes en el gen del TNF que contribueixin a crear diferències significatives en
les concentracions de lípids en el plasma (Fernandez-Real JM, 1997), són àmpliament
coneguts alguns efectes d’aquesta citocina sobre el metabolisme lipídic com ja s’ha
comentat a la introducció d’aquesta tesi. També alguns autors, entre els quals hi ha el
nostre grup, han descrit correlacions significatives entre les fraccions solubles dels
receptors 1 i 2 del TNF i els nivells de triglicèrids totals i HDLc (Fernandez-Real JM,
1999) i entre la citocina i els nivells de les VLDLtgl (Jovinge S, 1998).
En resum, en aquest treball descrivim un polimorfisme del gen de la IL-6 en la
posició –174 que podria determina diferències en els nivells circulants de certs paràmetres
lipídics, concretament en els triglicèrids, en les VLDLtgl i en els nivells d’àcids grassos
lliures tant en l’estat dejú com en estat postpandrial.
125
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
CONCLUSIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
6. CONCLUSIONS
126
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
CONCLUSIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Les conclusions derivades dels estudis que formen aquesta tesi són les següents:
ESTUDI 1.
Plasma levels of the soluble fraction of tumor necrosis factor receptor 2 and insulin
resistance. Diabetes 47:1757-62, 1998.
1- L’augment dels nivells circulants de les sTNFR2 està associat a una menor sensibilitat a
la insulina i a marcadors independents de resistència a la insulina com el BMI, la WHR
i la FFM.
2- La determinació dels nivells circulants de les sTNFR2 pot ser marcador de resistència a
la insulina mediada per TNF en l’obesitat.
ESTUDI 2.
Polymorhism of the tumor necrosis factor- receptor 2 gene is associated with
obesity, leptin levels, and insulin resistance in young subjects ans diet-treated type 2
diabetic patients. Diabetes Care 23:831-37, 2000.
1- La regió del gen que codifica per al TNFR2 podria ser un marcador genètic de
susceptibilitat a presentar diverses característiques fenotípiques de la síndrome
metabòlica.
ESTUDI 3
Interleukin-6 gene polymorphism and insulin sensitivity. Diabetes 49:517-20, 2000
1- El polimorfisme de restrició G>C en la posició – 174 del gen de la interleucina 6 podria
participar en la predisposició genètica en la determinació del grau de resistència a la
insulina
127
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
CONCLUSIONS
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
ESTUDI 4
Interleukin-6 gene polymorhism and lipid abnormalities in healthy subjects. J Clin
Endocrinol Metab 85:1334-39, 2000
1- Els nivells circulants dels lípids plasmàtics podrien estar parcialment determinats per
l’acció de variacions genètiques localitzades en el gen que codifica per la IL-6
128
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
7. BIBLIOGRAFIA
129
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Abbas AK, Lichtman AH, Pober S: Cytokines. En Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS,
editores. Celular and molecular immunology. Filadelfia: Caunders,267-92, 1995............. 29
Aderka D, Engelmann H, Maor Y, et al.: Stabilitation of the bioactivity of tumor necrosis
factor by its soluble receptors. J Exp Med 175:323-29, 1992 ....................................... 32, 83
Aggarwal B, and Natarajan K: Tumor necrosis factor:development during the last decade.
Eur Cytokine Netw 7:93-124, 1996 ..................................................................................... 28
Albert KGMM, Zimmet P, DeFronzo RA. International text book of Diabetes Mellitus.
Vol.1:437-46, 2 Edit 1997 .................................................................................................. 18
Arita Y, Kihara S, Morange P, et al.: Paradoxical decrease of an adipose-specific protein,
adiponectin, in obesity. Biochem and Bioph Res Co 257:79-83, 1999 ............................... 26
Baggio G, Donazzan S, Monti D, et al.: Lipoprotein(a) and lipoprotein profile in healthy
cantenarians: a reappraisal of vascular risk factors. FASEB J 12:433-37, 1998 ................. 96
Baker E, Chen L, Smith C, et al.: Chromosomal localitation of the human tumor necrosis
factor receptor genes. Cytogenet Cell Genet 57:117-18, 1991............................................ 32
Barnett A, Eff C, Leslie R, et al.: Diabetes in identical twins: A study of 200 pairs.
Diabetologia 20:87-93, 1981............................................................................................... 13
Baron AD, Zhu JS, Zhu JH, et al.: Glucosamine induces insulin resistance in vivo by
affecting GLUT 4 translocation in skeletal muscle. Implications for glucose toxicity J Clin
Invest 96(6):2792-01, 1995 ................................................................................................. 22
Barroso I, Gurnell M, Crowley VEF, et al.: Dominant negative mutations in human
PPARgamma associated with severe insulin resistance, diabetes mellitus and hypertension.
Nature 402:880-83, 1999..................................................................................................... 23
Bergman RN, Prager R, Volund A, et al.: Equivalence of the insulin sensitivity index in
man derived by the minimal model method and euglycaemic glucose clamp. J Clin Invest
79:700-800, 1987................................................................................................................. 66
Beutler B and Cerami A: Cachectin (tumor necrosis factor): a macrophage hormone
governing cellular metabolism and inflamatory resposte. Endocr Rev 9(1):57-66, 1988).. 34
Beutler B and Cerami A: Cachectin: a monokine implicated as a mediator of cachexia and
shock. Lynfokines 14:203-22, 1987 ..................................................................................... 28
Boden G and Chen X: Effects of fat on glucose uptake and utilization in patients with noninsulin-dependent diabetes. J Clin Invest 96:1261-68, 1995......................................... 23, 24
130
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Boden G, Jadali F, White J, et al.: Effects of fat on insulin-stimulated carbohydrate
metabolism in normal men. J Clin Invest 88(3):960-66, 1991............................................ 23
Boden G, Lebed B, Schatz M, et al.: Effects of acute changes of plasma free fatty acids on
intramyocellular fat content and insulin resistance in healthy subjects. Diabetes 50:161217, 2001 ............................................................................................................................... 24
Boden G: Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM.
Diabetes 46:3-10, 1997 ....................................................................................................... 15
Borkan GA, Hults DE, Gerzof SG, et al.: Age changes in body composition revealed by
computed tomography. J Gerontol 38:673-77, 1983 .......................................................... 14
Brakebusch C, Varfolomeev E, Batkin M, et al.: Structural requirements for inducible
shedding of the p55 tumor necrosis factor receptor. J Biol Chem 269:32488-96, 1994 ..... 32
Brinkman BM, Zuijdeest D, Kaijzel EL, et al.: Relevance of the tumor necrosis factor
alpha (TNF alpha) –308 promoter polymorphism in TNF alpha gene regulation. J Inflamm
46(1):32-41, 1995-96........................................................................................................... 43
Burant CF, Sreenan S, Hirano K, et al.: Troglitazone action is independent of adipose
tissue. J Clin Invest 100:2900-08, 1997 .............................................................................. 23
Caput D, Beutler B, Hartog K, et al.: Identification of a common nucleotide sequence in
the 3’untranslated region of messenger-RNA molecules specifying inflamatory mediators.
Proc Natl Acad Sci USA 83:1670-74, 1986......................................................................... 30
Caro J.F: Insulin receptor kinase in human skeletal muscle from obese subsjects with and
without non-insulin-dependent diabetes. J Clin Invest 79:1330-37, 1987 .......................... 20
Carswell E, Old L, Kassell R, et al.: An endotoxin-induced serum factor that causes
necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA 72:3666-70, 1975 ......................................... 28
Coleman DL: Obesity genes: beneficial effects in heterozygous mice. Science 203:663-65,
1979 ..................................................................................................................................... 16
Considine RV, Sinha MK, Heiman ML, et al.: Serum immunoreactive-leptin
concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med 334(5):292-95, 1996. 25
Chagnon YC, Perusse L and Bouchard C: The human obesity gene map: the 1997 update.
Obes Res 6:76-92, 1998....................................................................................................... 89
Chagnon YC, Perusse L, Lamothe M, et al.: Suggestive linkages between markers on
human 1p32-p22 and body fat and insulin levels in the Quebec family Study. Obes Res
5:115-21, 1997..................................................................................................................... 89
Charlotte H and Yuti Ch: Mutation of proline 211 reduces shedding of the human p75 TNF
receptor. J Immunol 160:2478-87, 1998.............................................................................. 33
131
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Charron MJ and Khan BB: Divergent molecular mechanisms for insulin-resistant glucose
transport in muscle and adipose cells in vivo. J Biol Chem 265:7994-00, 1990................. 35
Christian P, Peter S, John M, et al.: Physical mapping and genomic structure of the human
TNFR2 gene. Genomics 35, 94-100, 1996 .......................................................................... 32
D’Alfonso S and Richiardi PM: A polymorphic varition in putative regulation box of the
TNFA promoter region. Immunogenetics 39(2):150-54, 1994............................................ 43
De Vos P, Lefebvre A, Miller S, et al.> Thiazolidinediones repress ob gene expression via
activation of PPAR. J Clin Invest 98:1004-09, 1996......................................................... 25
Declercq W, Denecker G, Fiers W, et al.: Cooperation of both TNF receptors in inducing
apoptosis: Involvement of the TNF receptor-associated factor biding domain of the TNF
receptor 75. J Immunol 161:309-99, 1998........................................................................... 32
DeFronzo RA: Glucose tolerance and aging. Diabetes 28:1099-01, 1979 ......................... 14
Dembic Z, Loetsher H, Gubler U, et al.: Two human TNF receptors heve similar
extracellular, but distinct intracellular domain sequences. Cytokine 2:231-37, 1990......... 31
Doerrler W, Feingold KR and Grunfeld C: Cytokines induc catabolic effects in cultured
adipocytes by multiple mechanisms. Cytokine 6:478-84, 1994 .......................................... 34
Ebina Y, Ellis L, Jarnagin K, et al.: The human IR cDNA: the structural basis for hormoneactivated transmembrane signaling. Cell 40:747-58, 1985 ................................................. 17
Evans DA, Jacobs Do and Wilmore DW: Tumor necrosis factor enhances glucose uptake
by peropheral tissues. Am J Physiol 257 (5 Pt 2):R1182-89, 1989 ..................................... 35
Facchini F, Hollenbeck CB, Chen YN, et al.:Demostration of a relationship between white
blood cell count, insulin resistance, and several risk factors for corinary heart disease in
women. J Intern Med 232:267-72, 1992 ............................................................................. 92
Feinstein R, Kanety H, Papa MZ, et al.: Tumor necrosis factor-alpha suppresses insulininduced tyrosine phosphorylation of insulin receptor and its substrates. J Biol Chem
265(35):26055-58, 1993 ...................................................................................................... 35
Ferguson-Smith AC, Chen YF, Newman MS, et al.: Regional localization of the interferon
beta-2/B-cell stimulatory factor 2/hepatocyte stimulating factor gene to human
chromosome 7p15-p21. Genomics 2:203-08, 1988............................................................. 45
Fernandez-Real JM and Ricart W: Insulin resistance and inflammation in an evolutionary
perspective: the contribution of cytokine genotype/phenotype to thriftiness. Diabetologia
42:1367-74, 1999................................................................................................................. 16
132
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Fernandez-Real JM, Gutierrez C, Ricart W, et al.: Plasma levels of the tumor necrosis
factor receptors 1and 2 are independent determinants of plasma cholesterol and LDLcholesterol concentrations in healthy subjects. Atherosclerosis 146:321-27, 1999 ............ 97
Fernandez-Real JM, Gutierrez C, Ricart W, et al.: The TNF-alpha gene Nco I
polymorphism influences the relationship among insulin resistance, percent body fat, and
increased serum leptin levels. Diabetes 46(9):1468-72, 1997....................................... 43, 97
Ferrannini E: Insulin resistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent diabetes
mellitus: problems and prospects. Endocr Rev 19:477-90, 1998 ........................................ 12
Fiengold KR, Adi S, Staprans I, et al.: Diet affects the mechanisms by which TNF
stimulates hepatic triglyceride production. Am J Physiol 259:E177-87, 1990.................... 34
Fishman D, Faulds G, Jeffery R, et al.: The effect of novel polymorphisms in the
interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association
with systemic-onset juvenile chronic arthritis. J Clin Invest 102:1369-76, 1998 ... 49, 91, 96
Freidenberg G.R, Reichart D.R, Olefsky J.M, et al.: Reversibility of defective adipocyte
insulin receptor kinase activity in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Effect of weight
loss. J Clin Invest 82:1398-06, 1988 ............................................................................. 19, 20
Garrow GS, and Webster JD: Quetet’s index as a measure of fatness. Int J Obesity 9:14753, 1985 ......................................................................................................................... 55, 60
Greenberg AS, Nordan RP, McIntosh J, et al.: Interleukin 6 reduces lipoprotein lipase
activity in adipose tissue of mice in vivo and in 3T3-L1 adipocytes: a possible role for
interleukin 6 in cancer cachexia. Cancer Res 52(15):4113-116, 1992.................... 48, 95, 97
Grell M, Duoni E, Wajant H, et al.: The transmembrane form of tumor necrosis factor is
the prime activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor. Cell 83:793-02,
1996 ..................................................................................................................................... 29
Grunfeld C, Zhao C, Fuller J, et al.: Endotoxin and cytokines induce expression of leptin,
the ob product, in hamsters: a role for leptin in the anorexia of infection. J Clin Invest
97:2152-157, 1996............................................................................................................... 86
Guo D and Donner DB: Tumor necrosis factor promotes phosphorylation and binding of
insulin receptor substrate 1 to phosphatidylinotisol 3-kinase in 3T3-L1. J Biol Chem
271(2):615-18, 1996 ............................................................................................................ 35
Hallahan D, Spriggs D, Beckett M, et al.: Increased tumor necrosis factor mRNA after
cellular exposure to ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci USA 86:10104-07, 1989........ 28
Hansen T: Identification of a common amino acid polymorphism in the 85 regulatory
subunit of phosphatidylinositol 3-kinase: effects on glucose disapperance constant, glucose
effectiveness and the insulin sensitivity index. Diabetes 46:494-01, 1997......................... 21
133
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Hardy GH: Mendelian proportions in a mixed populations. Science 28:49-50, 1908......... 79
Haruhiko O, Hioshi O, Akiko M, et al.: Systematic sarch for single nucleotide
polymorphisms in the resistin gene. The absence of evidence for the association of the
three identified single nucleotide polymorphisms with japanese type 2 diabetes. Diabetes
51:863-66, 2002................................................................................................................... 27
Hauner H, Petruschke T, Russ M, et al.: Effects of tumour necrosis factor alpha on glucose
transport and lipid metabolism of newly-differentiated human fat cells in cell culture.
Diabetologia 38:764-71, 1995............................................................................................. 34
Heinrich PC, Castell JV and Andus T: Interleukin-6 and the acute phase resposte. Biochem
J 265:621-36, 1990 .............................................................................................................. 45
Hidehiko K, Iichiro S, Yuko M, et al.: Association of adiponectin mutation with type 2
diabetes. A candidate gene for insulin resistance syndrome. Diabetes 51:2325-328, 2002 26
Hirano T, Taga T, Nakano N, et al.: Purification to homogeneity and characterization of
human B-cell differentiation factor (BCDF or BSPp-2). Proc Natl Acad Sci USA 85:5490,
1985 ..................................................................................................................................... 45
Hotamisligil GS and Spiegelman BM: Tumor necrosis factor : a key component of the
obesity-diabetes link. Diabetes 43:1271-78, 1994 ........................................................ 15, 38
Hotamisligil GS, Arner P, Atkinson R, et al.: Differential regulation of the p80 tumor
necrosis receptor in human obesity and insulin resistance. Diabetes 46:451-55, 1997 32, 43,
82, 83
Hotamisligil GS, Arner P, Caro JF, et al.: Increased adipose tissue expression of tumor
necrosis factor- in human obesity and insulin resistance. J Clin Invest 95:2409-15, 1995
............................................................................................................................................. 83
Hotamisligil GS, Bubavari A, Murray D, et al.: Reduced tyrosine kinase activiy of the
insulin receptor in obesity-diabetes:central role of tumor necrosis factor. J Clin Invest 94:
1543-49, 1994...................................................................................................................... 35
Hotamisligil GS, Peraldi P, Budavari A, et al.: IRS-1 mediated inhibition of insulin
receptor tyrosine kinase activity in TNF- and obesity-induced insulin resistance. Science
271:665-68, 1996........................................................................................................... 35, 36
Hotta K, Funahaski T, Arita Y, et al.: Plasma concentrations of a novel, adipose-specific
protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol
20(6):1595-99, 2000 ............................................................................................................ 26
Houmard JA, Egan PC, Neufer PD, et al.: Elevated skeletal muscle glucose transporter
levels in exercise-trained middle-aged men. Am J Physiol 261:E437, 1991....................... 14
134
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Hu E, Liang P and Spiegelman B.M: AdipoQ is a novel adipose-specific gene dysregulated
in obesity. J Biol Chem 271:10697-703, 1996 .................................................................... 26
Hubbard SR, Wei L, Ellis L, et al.: Crystal structure of the tyrosine kinase domain of the
human IR. Nature 372:746-54, 1994................................................................................... 17
Hubbard SR: Crystal structure of the activated IR tyrosine kinase in complex with peptide
substrate and ATP analog. EMBO J 16:5572-81, 1997....................................................... 17
Janke J, Engeli S, Gorzelniak K, et al.: Resistin gene expression in humans adipocytes is
not related to insulin resistance. Obes Res 10(1):1-5, 2002 ................................................ 27
Jones E, Stuart D and Walter N: Structure of tumor necrosis factor. Nature 338:225-28,
1989 ..................................................................................................................................... 29
Jonsson A, and Wales JK: Blood glycoprotein levels in diabetes mellitus. Diabetologia
12:245-50, 1976................................................................................................................... 93
Jovinge S, Hamsten A, Tornvall P, et al.: Evidence for a role of tumor necrosis factor  in
disturbances of triglyceride and glucose metabolism predisposing to coronary heart
disease. Metabolism 47:113-18, 1998 ................................................................................. 97
Kadowaki T Bevins CL, Cama, A et at.: Two mutant alleles of the insulin receptor gene in
a patient with extreme insulin resistance. Science 240:787-90, 1988 ................................. 20
Kadowaki T, Kadowaki H, Yazaki Y: Polimorphism of the glycogen synthase gene and
non-insulin-dependent diabetes. N Engl J Med 328:1568-69, 1993 ................................... 21
Kahn BB: Facilitative glucosa transporters:regulatory mechanisms and dysregulation in
diabetes. J Clin Invest 89:1367-74, 1992 ............................................................................ 21
Kahn CR: Insulin action, diabetogenes and the cause of type II diabetes. Diabetes 43:106684, 1994 ............................................................................................................................... 21
Kahn SE, Leonetti DL, Prigeon RL, et al.: Proinsulin as a marker for the development of
NIDDM in japanese-American men. Diabetes 44(2):173-9, 1995 ..................................... 12
Kamohara S, Burcelin R, Halaas JL, et al.: Acute stimulation of glucose metabolism in
mice by leptin treatment. Nature 389:374-77, 1997............................................................ 25
Kaufman BA, White PS and Brodeur G: A complex single strand conformational
polymorphism (SSCP) in the tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) gene chromosome
1p36.2. Hum Mol Genet 2(6):824, 1993.............................................................................. 87
Kawakami M, Murase T, Ogawa H, et al.: Human recombinant TNF suppresses lipoprotein
lipase activity and stimulates lipolysis in 3T3-L1 cells. J Biochem 101:331-38, 1987 ...... 34
135
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Kellerer M and Haring H: Pathogenesis of human resistance: modulation of the insulin
signal at receptor level. Diabetes Res Clin Pract 28 (Suppl.):S173-S177, 1995 ................ 22
Kellerer M, Mushanck J, Seller E, et al.: Protein Kinase C isoforms alpha, delta and theta
require insulin recptor substarte-1 to inhibit the tyrosine kinase activity receptor in human
kidney embryonic cells (Hek 293 Cells). Diabetologia 41:833-38, 1998........................... 36
Kemper O, Derre J, Cherif D, et al.: The gene for the type II (p75) tumor necrosis factor
receptor (TNF-RII) is localized on band 1p36.2-p36.3. Hum Genet 87:623-24, 1994 ....... 32
Kern PA, Sahizadeh M, Ong JM, et al.: The expression of tumor necrosis factor in human
adipose tissue. J Clin Invest 95:2111-119, 1995 ................................................................. 42
Kirchgessner TG, Uysal KT, Wiesbrock SM, et al.: Tumor necrosis factor- contributes to
obesity-related hyperleptinemia by regulating leptin release from adipocytes. J Clin Invest
100:2777-782, 1997............................................................................................................. 86
Kissebah AH and Krakower GR: Regional adiposity and morbidity. Physiol Rev 74:76111, 1994 ......................................................................................................................... 15, 83
Kjos SL, Peters RK, Xiang C, et al.: Predicting future diabetes in Latino women with
gestacional diabetes\. Utility of early postpartum glucose tolerance testing. Diabetes
44:586-91, 1995................................................................................................................... 14
Klieger M, Perez C, DeFay K, et al.: A novel form of TNF/cachectin is a surface cytotoxic
transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell 53:45-53,
1988 ..................................................................................................................................... 29
Kohrt WM, Kirwan JP, Staten MA, et al.: Insulin resistance in aging is related to
abdominal obesity. Diabetes 42:273-71, 1993 .................................................................... 61
Kontoyiannis D, Pasparakis M, Piarro T, et al.: Impaired on/off regulation of TNF
biosystesis in mice lacking TNF AU –rich elements: implicationsfor joint and gutassociated immunopathologies. Immunity 1:387-98, 1999 ................................................. 30
Kostner GM, Molinari E, and Pichler P: Evaluation of a new HDL2/HDL3 quantitation
method based on precipitation with polyethylene glycol. Clin Chim Acta 148: 139-47, 1985
............................................................................................................................................. 67
Krauss RM, Grunfeld C, Doerrler WT, et al.: Tumor necrosis factor acutely increases
plasma levels of very low density lipoproteins of normal size and composition.
Endocrinology 127:1016-21, 1990 ...................................................................................... 34
Kroeger KM, Carville KS and Abraham LJ: The –308 tumor necrosis factor - promoter
polymorphism effects transcription. Mol Immunol 34:391-99, 1997.................................. 43
Krook A and O’Rahilly S: Mutant insulin receptors in syndromes of insulin resistance.
Bailliere Clin Enodrinol Metab 10:97-122, 1996 ............................................................... 19
136
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
LaCava EC, Halter JB and Porte D: Failure of islet -cell adaptation to insulin resistance in
NIDDM. Diabetes 34(Supl. 1):297, 1985 ........................................................................... 12
Lang CH, Dobrescu C and Bagby GJ: Tumor necrosis factor impairs insulin action on
peripheral glucose disposal and hepatic glucose output. Endocrinology 130:43-52, 1992. 35
Lemiuez S, Prud’homme D, Nadeau A, et al.: Seven years changes in body fat and visceral
adipose tissue in women, association with indices of plasma glucose-insulin homeostasis.
Diabetes Care 19:983-91, 1996 .................................................................................... 14, 83
Liu L, Karkanias GB, Morales JC, et al.: Intracerebroventricular leptin regulates hepatic
but not peripheral glucose fluxes. J Bio Chem 273:3110-67, 1998..................................... 25
Lyson K and McCann SM: The effect of interleukin-6 on pituitary hormone release in vivo
and in vitro. Neuroendocrinology 54:262-66, 1991 ............................................................ 45
Mantzoros CS, Moschos S, Avramopoulos I, et al.: leptin concentrations in relation to
body mass index and the tumor necrosis factor- system in humans. J Clin Endocrinol
Metab 82:3408-413,1997 .................................................................................................... 86
Matsusaka T, Fujikawa K, Nishido Y, et al.: Transcription factors NF-IL6 and NF-Kappa
B synergistically active transcription of the inflamatory cytokines, interleukin 6 and
interleukin 8. Proc Natl Acad Sci USA 90:10193-97, 1993 ................................................ 46
McClain DA and Crook ED: Hexosamines and insulin resistance. Diabetes 45:1003-09,
1996 ..................................................................................................................................... 22
McGarry JD: What if Minkowski had been ageusic? An alternative angle on Diabetes.
Science 258:766-70, 1992 ................................................................................................... 24
McMillan DE: Increased levels of acute-phase serum proteins in diabetes. Metabolism
38:1042-46, 1989................................................................................................................. 93
Memon RA, Feingold KR, Moser AH, et al.: Regulation of fatty acid transport protein and
fatty acid translocase mRNA levels by endotoxin and cytokines. Am J Physiol 37:E210-17,
1998 ..................................................................................................................................... 34
Mendall MA, Patel P, Asante M, et al.: Relation of serum cytokine concentration to
cardiovascular risk factors and coronary artery disease. Heart 78:273-77, 1997 ............... 96
Miles PD, Romero OM, Higo K, et al.: TNF-alpha-induced insulin resistance in vivo and
its pevention by troglitazone. Diabetes 46: 1678-83, 1997................................................. 34
Miyajima A, Kitamura T, Harada N, et al.: Cytokine receptors and signal transduction.
Annu Rev Immunol 10:295, 1992 ........................................................................................ 46
137
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Mohamed-Ali V, Goodrick S, Rawesh a, et al.: Subcutaneous adipose tissue releases
interleukin-6, but not tumor necrosis factor-, in vivo. J Clin Endocrinol Metab 82:4196200, 1997 ............................................................................................................................. 49
Moller DE: Potencial role of TNF- in the pathogenesis of insulin resistance and type 2
diabetes. Trends Endocrin Met 11:212-17, 2000 ................................................................ 39
Moller N, O`Brien P and Nair KS: Disruption of the relationship between fat content and
leptin levels with aging in humans. J Clin Endocrinol Metab 83:931-34, 1998........... 88, 89
Mullis K. And Faloona F: In Methods in enzymology. Vol.155, ed. R. Wu, Academic Press,
New York and London, 1987, p.335. .................................................................................. 72
Muoio DM, Dohm GL, Fiedorek FT, et al.: Leptin direcly alters lipid partitioning in
skeletal muscle. Diabetes 46:1360-63, 1997 ....................................................................... 25
Mynarcik DC, McNurlan MA, Steigbigel RT, et al.: Association of severe insulin
resistance with both loss of limb fat and elevated serum tumor necrosis factor receptor
levels in HIV lipodystrophy. JAIDS 25:312-21, 2000 ........................................................ 84
Nagaev I and Smith U: Insulin resistance and Type 2 diabetes are not related to resistin
expression in human fat cells or skeletal muscle. Biochem Bioph Res Co 285:561-64, 2001
............................................................................................................................................. 27
Nedwin G, Naylor S, Sakaguchi A, et al.: Human lymphotoxin and tumor necrosis factor
genes:structure, homology and chromosomal localitation. Nucleic Acids Res 13:6361-73,
1985 ..................................................................................................................................... 30
Neel JV: Diabetes mellitus: a “thrifty” genotype rendered detrimental by “progres?” Am J
Hum Genet 14:353-62, 1962 ............................................................................................... 15
Nguyen D, Eskandari M, DeForge L, et al.: Cyclosporin A modulation of tumor necrosis
factor gene expression and effects in vivo and in vitro. J Immunol 144:3822-28, 1990..... 29
Nonogaki K, Fuller GM, Fuentes NL, et al.: Interleukin-6 stimulates hepatic triglyceride
secretion in rats. Endocrinology 136:2143-49, 1995............................................... 48, 95, 97
Noriyuki O, Shinji K, Yukio A, et al.: Novel Modulator for endothelial adhesion
molecules. Adipocyte-derived plasma protein adiponectin. Circulation 100:2473-476, 1999
............................................................................................................................................. 26
O’Rahilly S, Turner RC and Matthews DR: Impaired pulsatil secretion of insulin in
relatives of patients with non-insulin-dependent diabetes. New Engl J Med 318(19):122530, 1988 ............................................................................................................................... 12
Oral EA, Simha V, Ruiz E, et al: Leptin-replacement therapy for lipodystrophy. N Engl J
Med 21:346(8):570-78, 2002............................................................................................... 90
138
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Orban Z, Remaley AT, Sampson M, et al.: The diferential effect of food intake and Adrenergic stimulation on adipose-derived hormones and cytokines in man. J Clin
Endocrinol Metab 84:2126-33, 1999 ............................................................................ 49, 91
Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, et al.: Detection of polymorphisms of human DNA by
gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphism. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA 86:2766, 1989 ............................................................ 71
Pan DA, Lillioja S, Kriketos AD, et al.: Skeletal muscle triglyceride levels are inversely
related to insulin action. Diabetes 46:983-88, 1997............................................................ 24
Paolisso G, Rizzo MR, Mazziotti G, et al.: Advancing age and insulin resistance: role of
plasma tumor necrosis factor-alpha. Am J Physiol 275:E294-E299, 1998 ......................... 88
Pape ME and Kim KH: Effect of tumor necrosis factor on acetyl-coenzyme A carboxylase
gene expression and preadipocyte differentiation. Mol Endocrinol 2:395-03, 1988 .......... 34
Paz K, Hemi R, LeRoith D, et al.: A molecular basis for insulin resistance. Elevated
serine/threonine phosphorylation of IRS-1 and IRS-2 inhibits their binding to the
juxtamembrane region of the insulin-induced tyrosine phosphorylation. J Biol Chem
272(47):29911-18, 1997 ...................................................................................................... 36
Pickup JC and Crook MA: Is type II diabetes mellitus a disease of the innate immune
system? Diabetologia 41:1241-48, 1998....................................................................... 91, 93
PicKup JC, Mattock MB, Chusney GD, et al.: NIDDM as a disease of the innate immune
system: association of acute-phase reactans and interleukin-6 with metabolic syndrome X.
Diabetologia 40:1286-92, 1997................................................................... 16, 49, 91, 93, 95
Pugeat M, Bonneton A, Perrot D, et al.: Decreased immunoreactivity and binding activity
of corticosteroid-binding globulin in serum in septic shock. Clin Chem 35:1675-79, 1989
............................................................................................................................................. 70
Qian H, Hausman GJ, Compton MM, et al.: Leptin regulation of peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma, tumor necrosis factor, and uncoupling protein-2 expression in
adipose tissues. Biochem Biophys Res Commun 246:660-67, 1998.................................... 89
Quetelet LAS: Physique social.Vol.2 Brussels C. Muquardt, 92, 1869. ............................. 60
Reaven G, Hollenbeck C, Jeng C-Y, et al.: Measurement of plasma glucose, free fatty acid,
lactate and insulin for 24 h. In patients with NIDDM. Diabetes 37:1020-24, 1988 ........... 23
Report of The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetis Mellitus.
Diabetes Care 20: 1183-97, 1997 ................................................................................. 56, 65
Ricart W, Gonzalez-Huix F and Conde V: Evaluation of the nutritional status through
determination of anthropometric parametres: new charts for the working population of
139
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Catalonia. Group for the evaluation of body composition in the population of catalonia.
Med Clin (Barc) 100(18):681-91, 1993............................................................................... 63
Ristow M, Muller-Wieland D, Pfeiffer A, et al.: Obesity associated with a mutations in a
genetic regulator of adipocyte differentiation. N Engl J Med 339:953-59, 1998................ 23
Rondinone C M: Insulin receptor substrate (IRS) 1 is reduced and IRS-2 is the main
docking protein for phosphatidylinositol 3-kinase in adipocytes from subjects with noninsulin-dependent diabetes mellitus. Proc Natl Acad Sci USA 94:4171-75, 1997 .............. 20
Rossetti L: Glucose toxicity: the implications of hyperglycemia in the pathophysiology of
diabetes mellitus. Clin Invest Med 18:255-60, 1995 ........................................................... 22
Saghizadeh M, Ong JM, Garvey WT, et al.: The expression of TNF by human muscle:
relationship to insulin resistance. J Clin Invest 97:1111-16, 1996.................... 28, 42, 83, 84
Santomauro A, Boden G, Silva M, et al.: Overnight lowering of free faty acids with
acipimox improves insulin resistance and glucose tolerance in obese diabetic and nondiabetic subjects. Diabetes 48:1836-41, 1999 ..................................................................... 24
Schindler R, Mancilla J, Endres S, et al.: Correlations and interactions in the production of
interleukin-6 (IL-6), IL-1, and tumor necrosis factor (TMF) in human blood mononuclear
cells: IL-6 supresses IL-1 and TNF. Blood 75:40-7, 1990 .................................................. 45
Semb H, Peterson J, Tavernier J, et al.: Multiple effects of tumor necrosis factor on
lipoprotein lipase in vivo. J Biol Chem 262:8390-94, 1987................................................ 34
Sentinelli F, Romero S, Arca M, et al.: Human resistin gene, obesity, and type 2 diabetes.
Mutation analysis and population study. Diabetes 51:860-62, 2002 .................................. 27
Shepherd PR, and Kahn BB: Glucosa transporters and insulin action. Implications for
insulin resistance and diadetes mellitus. N Engl J Med 341:248-57, 1999 ......................... 19
Shereyer S, Chua S and LeBoeuf R: Obesity and diabetes in TNF- receptor-deficient
mice. J Clin Invest 102(2):402-11, 1998 ............................................................................. 38
Shimomura I, Tokunaga K, Katani K, et al.: Marked enhancement of acetil-Co synthetase
activity and mRNA in intra-abdominal visceral fat by physical exercise. Am J Physiol
265:44-50, 1993................................................................................................................... 24
Sims EAH, Danforrth E Jr, Horton ES, et al.: Endocrine and metabolic effects of
experimental obesity in man. Recent Prog Horm Res 29:457-96, 1973 ............................. 14
Smith C, Davis T, Anderson D, et al.: A receptor for the tumor necrosis factor defines an
unusual family of cellular and viral proteins. Science 248:1019-23, 1990 ......................... 31
Smith C, Farrah T and Goodwind, R: The TNF receptor superfamily of celular and viral
proteins: activation, costimulation, and death. Cell 76:959-62, 1994 ................................. 32
140
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Spiegelman BM: PPAR: adipogenic regulator and thiazolidinedione receptor. Diabetes
47:507-14, 1998............................................................................................................. 22, 23
Stephens JM and Pekkala PH: Transcriptional repression of the C/EBP-alpha and GLUT4
genes in 3T3-L1 adipocytes by tumor necrosis factor-: regulation is coordinate and
independent of protein synthesis. J Biol Chem 267:13580-84, 1992 .................................. 35
Stephens JM and Pekkala PH: Transcriptional repression of the GLUT4 and C/EBP genes
in 3T3-L1 adipocytes by tumor necrosis factor-. J Biol Chem 266:21839-45, 1991........ 35
Stephens JM, Lee J and Pilch PF: Tumor necrosis factor-alpha-induced insulin resistance
in 3T3-L1 adipocytes is accompanied by a loss of insulin receptor substrate-1 and GLUT4
expression without a loss of insulin receptor-mediated signal transduction. J Biol Chem
272(2):971-76, 1997 ............................................................................................................ 36
Steppan C, Bailey S, Bhat S, et al.: The hormone resistin links obesity to diabbetes. Nature
409:307-12, 2001................................................................................................................. 26
Stouthard JM, Romijn JA, Van Der Poll T, et al.: Endocrinologic and metabolic effects of
interleukin-6 humans. Am J Physiol 268:E813-E819, 1995................................................ 49
Stuber F, Udalova IA, Book M, et al.: -308 tumor necrosis factor (TNF) polymorphism is
not associated with survival in severe sepsis and is unrelated to lipopolysaccharide
inducibility of the human TNF promoter. J Inflamm 46(1):42-50, 1995-96....................... 43
Targher G, Seidell JC, Tonoli M, et al.: The white blood cell count: its relationship to
plasma insulin and other cardiovascular risk factors in healthy male individuals. J Intern
Med 239:435-41, 1996......................................................................................................... 92
Tartagalia L, Pennica D, Goeddel D: Ligand passing: The 75-kDa tumor necrosis factor
(TNF) receptor recruits TNF for signaling by the 55-kDa TNF receptor. J Biol Chem 268:
18.542-48, 1993................................................................................................................... 32
Tsai EY, Yie J, Thanos D, et al.: Cell-type-specific regulation of the tumor necrosis factor
alpha gene in B cells and T cells by NFATp and ATF-2/JUN. Mol Cell Biol 16:5232-44,
1996 ..................................................................................................................................... 30
Ullrich A, Bell JR, Chen EY, et al.: Human IR and its relationship to the tyrosine kinase
family of oncogenes. Nature 313:756-61, 1985.................................................................. 17
Uysal K, Wiesbrock S and Hotamisligil G: Functional analysis of tumor necrosis factor
(TNF) receptors in TNF--mediated insulin resstance in genetic obesity. Endocrinology
139:4832-38, 1998............................................................................................................... 39
Uysal K, Wiesbrock S, Marino M, et al.: Protection from obesity-induced insulin resistance
in mice lacking TNF- function. Nature 389(9):610-14, 1997..................................... 38, 39
141
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Vague J: La differentiation sexuelle, facteur determinant des formes d’obesité. La Presse
Medicale 53:339, 1947 ........................................................................................................ 61
Van Dijk W and Mackiewicz A: Interleukin-6-type cytokine-induced changes in acute
phase protein glycosylation. Ann N Y Acad Sci 762:319-30, 1995 ..................................... 92
Ventre J, Doebber T, Wu M, et al.: Targeted disruption of tumor necrosis factor- gene.
Diabetes, 46:1526-31, 1997 ................................................................................................ 38
Vgontzas AN, Papnicolaou DA, Bixler EO, et al.: Elevation of plasma cytokines in
disorders of excessive daytime sleepiness: role of sleep disturbance and obesity. J Clin
Endocrinol Metab 82:1313-16, 1997 .................................................................................. 49
Vionnet N, Hani EI-H, Dupont S, et al.: Genomewide search for type 2 diabetessusceptibility genes in French whites: evidence for a novel susceptibility locus for earlyonset diabetes on chromosome 3q27-qter and independent replication of a type 2-diabetes
locus on chromosome 1q21-q24. Am J Hum Genet 67:1470-80, 2000............................... 26
Wahlefeld AW: Lipoproteins. In Methoden der Enzymatischen Analyse. Vol. 2, 3rd
ed.Bergmeyer HU, Ed. Weinheim, Germany, Verlag Chemie, 1974, p. 187-88 ................ 68
Weidner MD, Gavigen KE, Tyndall GL, et al.: Which anthropometric indices of regional
adiposity are related to the insulin resistance of aging?. Int J Obesity 19:325-30, 1995 .... 61
Weiss T, Grell B, Hessabi S, et al.: Enhancement of TNF receptor p60-mediated
cytotoxicity by TNF receptor p80: requirement of the TNF receptor-associated factor 2
binding site. J Immunol 158:2398, 1997 ............................................................................. 32
Weyer C, Funahashi T, Tanaka S, et al.: Hypoadiponectinectinemia in obesity and type 2
diabetes: close association with insulin resistance and hyperinsulinemia. J Clin Endocrinol.
Metab 86:1930-35, 2001 ..................................................................................................... 26
Wilson AG, di Giovine FS, Blakemore et al.: Single base polymorphism in the human
necrosis factor alpha (TNF) gene detectable by NcoI restriction of PCR product. Hum
Mol Genet 1(5):353, 1992 ................................................................................................... 43
Wilson AG, Symons JA, Mcdowell TL, et al.: Effects of a polymorphism in the human
tumor necrosis factor  promoter on transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci
94:3195-199, 1997............................................................................................................... 43
Wu WS and McClain KL: DNA polymorphisms and mutations of the tumor necrosis
factor-alpha (TNF-alpha)promoter in Langerhans cell histiocytosis (LCH). J Interferon
Cytokine Res 17(10):631-35, 1997 ...................................................................................... 43
Wurtman RJ: What is leptin for and does it act on the brain? Nat Med 2:294-93, 1996 .... 26
142
UNIVERSITAT ROVIRA I VIRGILI
CONTRIBUCIÓ DE LES CITOCINES PROINFLAMATÒRIES, FACTOR DE NECROSI TUMORAL ALFA (TNE-a) I INTERLEUCINA 6 (IL-6),
A LA RESISTÈNCIA A LA INSULINA. ESTUDI SEROLÒGIC I GENÈTIC
Montserrat Broch Montané
BIBLIOGRAFIA
ISBN:978-84-693-4067-7/DL:T-1165-2010
Yoshimura R: Impact of natural IRS-1 mutations of insulin signals: mutations of IRS-1 in
the PTB domain and near SH2 protein binding sites result in impaired function at different
steps of IRS-1 signaling. Diabetes 46:929-36, 1997 ........................................................... 20
Zawalich WS and Kelley GG: The pathogenesis of NIDDM: the role of the pancreatic
beta cell. Diabetologia 38:986-91, 1995 ............................................................................. 12
Zhang X, Webwer M and Chen M: Site directed mutational analysis of human tumor
necrosis factor-alpha receptor binding site and structure-functional relationship. J Biol
Chem 267: 24069-75, 1992 ................................................................................................. 29
Zumbach MS, Boehme MW, Wahl P, et al.: Tumor necrosis factor increases serum leptin
levels in humans. J Clin Endocrinol Metab 82:4080-82, 1997 ........................................... 86
143
Fly UP