...

SHIGA-TOKSIINIA TUOTTAVAN E. COLI -BAKTEERIN TUNNISTAMISEEN TARKOITETUN PCR-MENETELMÄN

by user

on
Category: Documents
6

views

Report

Comments

Transcript

SHIGA-TOKSIINIA TUOTTAVAN E. COLI -BAKTEERIN TUNNISTAMISEEN TARKOITETUN PCR-MENETELMÄN
SHIGA-TOKSIINIA TUOTTAVAN
E. COLI -BAKTEERIN TUNNISTAMISEEN
TARKOITETUN PCR-MENETELMÄN
VALIDOINTI
Iida Hurskainen
Maija Kuitunen
Opinnäytetyö
Syyskuu 2015
Bioanalyytikkokoulutus
TIIVISTELMÄ
Tampereen ammattikorkeakoulu
Bioanalyytikkokoulutus
12BIO
HURSKAINEN IIDA & KUITUNEN MAIJA:
Shiga-toksiinia tuottavan E. coli -bakteerin tunnistamiseen tarkoitetun PCR-menetelmän
validointi
Opinnäytetyö 42 sivua, joista liitteitä 3 sivua
Syyskuu 2015
Shiga-toksiinia tuottava E. coli (STEC), tunnetaan myös nimellä enterohemorraginen E.
coli (EHEC), on ruokamyrkytyksiä aiheuttava bakteeri. EHEC on yleisvaarallinen
tartuntatauti, jota on esiintynyt maailmanlaajuisesti 1980-luvulta ja Suomessa 1990-luvun
puolivälistä lähtien. Sen kantajia ovat märehtijät, joiden ulosteesta kontaminoituneet
elintarvikkeet, vesistöt ja juomavesi voivat aiheuttaa tartuntoja. Taudinkuva voi vaihdella
oireettomasta infektiosta veriseen ripuliin ja hemolyyttis-ureemiseen oireyhtymään.
Lapsilla ja vanhuksilla on kohonnut riski vakavaan taudinkuvaan.
Opinnäytetyön toimeksiantaja oli Fimlab Laboratoriot Oy:n mikrobiologian yksikkö,
jossa aiempi viljelyyn ja toksiiniosoitukseen perustuva tunnistusmenetelmä ollaan
korvaamassa herkemmällä PCR-menetelmällä. Opinnäytetyön tavoitteena oli suorittaa
menetelmälle osavalidointi ja tuottaa tietoa sen käyttöönottoa varten. Tarkoituksena oli
testinäytteitä analysoimalla saada tuloksia, joiden perusteella voidaan määrittää
menetelmälle sensitiivisyys ja spesifisyys.
Tutkimuksessa analysoitiin käyttöönotettavalla kaupallisella RIDA®GENE STEC tutkimuspakkauksella 45 kantakokoelmien kantaa, neljän eri laimennoksen
laimennossarja sekä kaksi keinotekoista potilasnäytettä. Kaikki analysoitavat näytteet
määritettiin QIAGENin Rotor-Gene® Q MDx -real-time-PCR-laitetta käyttäen.
Tulosten perusteella menetelmä tunnistaa STEC-positiiviset ja STEC-negatiiviset
näytteet. Tutkittu laimennossarja osoitti menetelmän herkkyyden yhteneväisyyden
tutkimuspakkauksen valmistajan ilmoittaman havaitsemisrajan kanssa. Käytetty
tutkimuspakkaus osoittautui näiden määritysten perusteella toimivaksi. Fimlab
Laboratoriot Oy jatkaa menetelmän käyttöönottoa analysoimalla näytteitä PCRmenetelmällä rinnakkain viljelyn ja serotyypityksen kanssa.
Asiasanat: EHEC, STEC, PCR, validointi
ABSTRACT
Tampereen ammattikorkeakoulu
Tampere University of Applied Sciences
Degree programme in Biomedical Laboratory Science
HURSKAINEN IIDA & KUITUNEN MAIJA:
The Validation of PCR Assay for Detection of Shiga-Toxin Producing E. coli
Bachelor's thesis 42 pages, appendices 3 pages
September 2015
Shiga-toxin producing E. coli (STEC) can cause severe food poisoning called EHEC
(enterohaemorrhagic Escherichia coli) which can develop into haemolytic-uremic
syndrome. Infections are caused by contaminated food and water. In 2014 there were 64
infections in Finland.
The topic for this study was provided by Fimlab Laboratories where there was an interest
for more accurate method of detecting Shiga-toxin producing E. coli than the current
cultivating, serotyping and immunochromatocraphic detection of Shiga-toxin. The
objective of this study was to assist the Fimlab Laboratories unit of microbiology with
validation of the method and provide data for the implementation. The purpose was to
provide data for determining the sensitivity and specificity of the method.
The study was quantitative in nature, and based on analysing 45 known bacteria strains,
four dilutions made from STEC positive samples, and two artificial patient samples. To
determine the sensitivity of the PCR, 4-fold dilutions of E. coli reference strain was
analysed. All the samples were analysed with a Rotor-Gene® Q MDx and by using RIDA®
GENE STEC kit.
The study showed that the method is capable of differentiating between STEC positive
and negative samples. The mildest dilution, the concentration of which was below the
detection limit stated by the manufacturer of the test kit, was detected. Therefore
analytical sensitivity was proved to be satisfactory. According to the results of this study
the used kit is suited for detection of Shiga-toxin producing E. coli and Fimlab
Laboratories continues the validation and the implementation by analysing samples sideby-side with current detection methods.
Key words: EHEC, STEC, PCR, validation
4
SISÄLLYS
1 JOHDANTO ...................................................................................................... 5
2 SHIGA-TOKSIINIA TUOTTAVA E. COLI .................................................... 6
2.1 Shiga-toksiini ............................................................................................. 7
2.2 Enterohemorraginen E. coli (EHEC) -infektio .......................................... 8
2.3 Shiga-toksiinia tuottavan E. coli -bakteerin tunnistus ............................. 10
3 DNA:N ERISTYS JA PUHDISTUS ............................................................... 12
4 POLYMERAASIKETJUREAKTIO-MENETELMÄ .................................... 13
4.1 Menetelmän periaate ................................................................................ 13
4.2 Multiplex-PCR ......................................................................................... 14
4.3 Reaaliaikainen PCR ................................................................................. 14
5 MENETELMIEN VALIDOINTI KLIINISESSÄ LABORATORIOSSA...... 17
6 TAVOITE, TARKOITUS JA TEHTÄVÄT ................................................... 19
7 OPINNÄYTETYÖN MENETELMÄ ............................................................. 20
8 OPINNÄYTETYÖPROSESSI ........................................................................ 21
9 KÄYTÄNNÖN SUORITUS ........................................................................... 22
9.1 RIDA®GENE STEC -tutkimuspakkaus ................................................... 22
9.2 Rotor-Gene® Q MDx -PCR-laite ............................................................. 23
9.3 DNA:n eristys .......................................................................................... 24
9.4 Laimennossarja ........................................................................................ 25
9.5 PCR-ajon suoritus .................................................................................... 26
10 TULOKSET .................................................................................................... 28
10.1 PCR-määritysten tulokset ........................................................................ 28
10.2 Tulosten yhteenveto ................................................................................. 31
11 POHDINTA..................................................................................................... 33
LÄHTEET ............................................................................................................. 36
LIITTEET ............................................................................................................. 40
Liite 1. Siirrostetut Fimlab Laboratoriot Oy:n bakteerikannat ........................ 40
Liite 2. Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen kannat ...................................... 42
5
1
JOHDANTO
Shiga-toksiinia tuottava E. coli (STEC) on ruokamyrkytyksiä aiheuttava bakteeri.
Tartunnanlähteitä ovat pääasiassa kontaminoituneet elintarvikkeet, kuten liha- ja
maitotuotteet sekä saastuneella vedellä kastellut kasvikset. (WHO 2011.) STEC-kannat
tunnetaan myös nimellä EHEC (enterohemorraginen E. coli), joka on vakiintunut yleiseen
käyttöön sairaudesta ja bakteerikannoista puhuttaessa (Siitonen & Vaara 2010). Tässä
opinnäytetyössä bakteerikannoista käytetään termiä STEC ja sairaudesta termiä EHEC.
EHEC-tartuntoja on esiintynyt maailmanlaajuisesti 1980-luvulta, ja Suomessa 1990luvun puolivälistä lähtien (Kokki 1998; WHO 2011). Vuonna 2014 Suomessa todettiin
64 EHEC-tartuntaa (THL 2015b). Tartunta voi aiheuttaa veristä ripulia ja
vatsakramppeja.
Joissain
tapauksissa
se
voi
johtaa
hemolyyttis-ureemiseen
oireyhtymään, jossa esiintyy vakavaa munuaisten vajaatoimintaa sekä hemolyyttistä
anemiaa ja trombosytopeniaa. (WHO 2011.)
Opinnäytetyön toimeksiantaja oli Fimlab Laboratoriot Oy:n mikrobiologian yksikkö.
Fimlab Laboratoriot Oy käyttää EHEC:n osoitukseen bakteeriviljelyä, toksiinin tuoton
osoittamista sekä O157 -serotyypitystä. Positiivisesta bakteeriviljelystä suoritetaan
immunokromatografinen toksiiniosoitus, jossa erotellaan Stx1- ja Stx2-toksiinit. Jos
toksiineita havaitaan, suoritetaan E. coli O157 latex -testi, joka kertoo onko bakteeri
O157-seroryhmää. (Fimlab Laboratoriot Oy 2014a; Fimlab Laboratoriot Oy 2014b.)
Viljely on menetelmänä hidas ja toksiiniosoitus havaitsee toksiinin vasta, kun sitä on
näytteessä paljon. Tämän takia Fimlab Laboratoriot Oy on ottamassa käyttöön PCRmenetelmää. (Hirvonen 2015.) Vuonna 2013 HUSLAB-laboratorio siirtyi käyttämään
PCR-pohjaista menetelmää, mikä paransi EHEC-tutkimuksen herkkyyttä (HUSLAB
2013).
Opinnäytetyön tavoitteena oli osavalidoida menetelmä ja tuottaa tietoa sen
käyttöönottamiseksi. Tarkoituksena oli tuottaa menetelmällä analyysituloksia, joiden
perusteella voidaan määrittää kuinka herkästi ja tarkasti menetelmä havaitsee Shigatoksiinia koodaavaa geeniä. Tutkimuksen tehtävänä oli selvittää kuinka hyvin
käyttöönotettava menetelmä soveltuu Shiga-toksiinia tuottavan E. coli -bakteerin
tunnistamiseen ja millainen on menetelmän sensitiivisyys ja spesifisyys.
6
2
SHIGA-TOKSIINIA TUOTTAVA E. COLI
Escherichia coli on gramnegatiivinen sauvabakteeri, joka kuuluu Escherichia-sukuun ja
Enterobacteriaceae-heimoon. Termiä Escherichia coli käytetään useista eri kannoista,
jotka ovat erittäin läheistä sukua toisilleen. Näillä kannoilla on samankaltainen
aineenvaihdunta,
mutta
ne
eroavat
esimerkiksi
virulenssiltaan
eli
taudinaiheutuskyvyltään. (Siitonen & Vaara 2010.)
E. coli on enterobakteeri. Sen ensisijainen kasvuympäristö on ihmisten ja eläinten
suolistoissa. Useat kannat selviytyvät myös vedessä ja maaperässä. (Morabito 2014, ix.)
Ihmisen suoliston normaalifloorasta yksi prosentti on aerobisia bakteereita ja näistä
valtaosa on eri E. coli -kantoja (Siitonen & Vaara 2010). E. coli pitää yllä suoliston
bakteeritasapainoa estämällä patogeenisempien mikrobien pääsyä valtakasvuksi.
Päätyessään suoliston ulkopuolelle se voi aiheuttaa infektioita, joista yleisimpiä ovat
virtsatieinfektio ja sepsis. Osalla E. coli -kannoista on suolistoinfektioita aiheuttavia
ominaisuuksia. Näitä ovat esimerkiksi enterohemorraginen EHEC, enterotoksigeeninen
ETEC, enteropatogeeninen EPEC, enteroinvasiivinen EIEC, enteroaggregatiivinen
EAEC sekä diffuusisti adheroituvat DAEC-kannat. (Morabito 2014, ix.)
Shiga-toksiinia tuottavat E. coli (STEC) -bakteerit ovat kolibakteereita, jotka tuottavat
niiden kromosomiin liittyneen bakteriofagin koodaamaa toksiinia. Tämä toksiini on
samankaltainen kuin Shigella dysenteriaen tuottama toksiini. STEC-kannat tunnetaan
myös nimellä enterohemorraginen E. coli (EHEC) niiden usein aiheuttaman suoliston
verenvuodon mukaan (Tozzoli & Scheutz 2014, 10). Yleisesti termiä EHEC käytetään
kaikista STEC-kannoista ja -tapauksista, vaikka täsmällisesti se tarkoittaa vain vakavan
taudinkuvan aiheuttavia kantoja (Siitonen & Vaara 2010).
Shiga-toksiinia tuottaville E. coli -kannoille voidaan määrittää serotyyppi O- ja Hantigeenien mukaan. E. coleilla O-antigeeneja on 181 ja H-antigeenejä yli 50. O-antigeeni
on yksi gramnegatiivisten bakteerien tärkeimmistä pinta-antigeeneistä. Se on osa
lipopolysakkaridia (LPS), jota on noin puolet bakteerin ulkomembraanin massasta. Hantigeenit ovat värekarvoja eli flagelloja, joiden avulla bakteeri liikkuu. (Tortora, Funke
& Case 2013, 82, 86; Siitonen & Vaara 2010.) Yli 400 Shiga-toksiinia tuottavaa O:Hserotyyppiä on eristetty potilasnäytteistä (Tozzoli & Scheutz 2014, 11). Yleisin
7
epidemioita aiheuttava STEC-kanta on O157:H7. Tämän lisäksi tärkeimpiä kantoja ovat
O26, O91, O103, O111, O128 ja O148. Kaikkien Shiga-toksiinia tuottavien E. coli kantojen ei ole todettu aiheuttavan sairastumisia. (Smith, Fratamico & Gunther 2014,
147.)
Ruuansulatuskanavaan päässyt STEC-bakteeri ei tunkeudu paksusuolen epiteelisolujen
sisään, vaan vaikuttaa isäntäsolun toimintaan injektoimalla siihen proteiineja tyypin
kolme eritysjärjestelmän (T3SS) kautta (Coburn, Sekirov & Finlay 2007; Smith ym. 2014
151–152; Yang, Feng, Wang & Wang 2015). Shiga-toksiinia tuottavilla E. coli bakteereilla on LEE (Locus of Enterocyte Effacement)-patogeenisuussaareke, joka
sisältää virulenssiin vaikuttavia geenejä. LEE-patogeenisuussaarekkeen geenit koodaavat
tyypin kolme eritysjärjestelmää ja sen kautta injektoitavia proteiineja. Näiden tekijöiden
avulla STEC-bakteeri voi kiinnittyä tiukasti, aiheuttaa hemolyysiä, inhiboida
fagosytoosia, monistua ja aiheuttaa tautia. (Smith ym. 2014, 152.) Tärkeä kiinnittymiseen
ja siten virulenssiin vaikuttava geeni on eaeA, jonka esiintymistä tutkitaan
polymeraasiketjureaktiolla, kun kannalle tehdään tarkka tyypitys (Smith ym. 2014, 152;
THL 2015d).
2.1
Shiga-toksiini
Shiga-toksiini on eksotoksiini. Eksotoksiinit ovat proteiineja, usein entsyymejä, jotka
vaikuttavat spesifisti tietyissä kudoksissa tiettyihin solurakenteisiin tai toimintoihin. Ne
liukenevat helposti ja kulkeutuvat nopeasti ympäri kehoa. Eksotoksiinit voidaan jakaa
ryhmiin toimintojen ja rakenteen perusteella. Shiga-toksiini on AB-tyypin toksiini. Sen
B-alayksikkö (binding) sitoutuu glykolopidireseptoreihin, joita on suoliston, munuaisten
ja verisuonten epiteeleillä. A-alayksikkö (active) on entsyymi, joka solun sisään
päästyään muuttaa solun toimintaa hidastamalla proteiinisynteesiä ja johtaa erityisesti
munuaisten endoteelisolujen apoptoosiin. (Smith ym. 2014, 149; Tortora ym. 2013, 437–
438.)
Shiga-toksiinia tuottavat E. coli -bakteerit tuottavat kahta toksiinia: Stx1:a, joka on
identtinen Shigella dysenteriaen tuottaman toksiinin kanssa, ja Stx2:a, jonka sekvenssistä
noin 60 % on yhtenevä Stx1:n kanssa (Smith ym. 2014, 149). STEC-bakteerit voivat
tuottaa vain toista tai molempia Shiga-toksiineja (Tozzoli & Scheutz 2014, 10). Shiga-
8
toksiini 1:llä on kolme varianttia (Stx1a, Stx1c ja Stx1d) ja Shiga-toksiini 2:lla seitsemän
eri varianttia (Stx2a–Stx2g) (Smith ym. 2014, 149).
Potilasnäytteistä eristettyjen kantojen perusteella Stx2a:n on todettu olevan virulentimpi
ja voimakkaampi kuin Stx1. Stx2a johtaa useammin vakavampien oireiden
kehittymiseen. (Smith ym. 2014, 149–150.) Shiga-toksiinien voimakkuutta on vertailtu
hiirikokein. Kerralla annettu määrä ainetta, joka tappaa 50 % koe-eläimistä (LD 50 ) on
Stx1:llä yli 1000 nanogrammaa, kun taas Stx2a:n LD 50 on 6,5 nanogrammaa. (Canadian
Centre for Occupational Health and Safety. 2013; Smith ym. 2014, 149.)
2.2
Enterohemorraginen E. coli (EHEC) -infektio
Enterohemorraginen E. coli aiheuttaa yleisvaarallista tartuntatautia, joka on aiheuttanut
ruokamyrkytyksiä 1980-luvulta lähtien (THL 2015d; WHO 2011). Yksi tunnetuimmista
epidemioista puhkesi Saksassa vuonna 2011, jolloin yli 3800 sai tartunnan ja 53 kuoli
(Siitonen & Kuusi 2013). Suomessa tartuntoja on seurattu vuodesta 1994. Ensimmäinen
epidemia todettiin vuonna 1997, jota ennen oli diagnosoitu vain yksittäisiä tapauksia.
(Kokki 1998.) Suomessa todetut EHEC-tartunnat esitetään taulukossa 1.
TAULUKKO 1. EHEC:n esiintyvyys Suomessa. (THL 2015a.)
120
98
100
80
65
64
60
52
44
40
29
18 17 16 16
20
0
39
0
2
21
10
21
14 12
8
27
31
9
Märehtijät, erityisesti nautakarja, ovat STEC-kantojen oireettomia kantajia. Bakteeria
erittyy ulosteeseen, mikä voi kontaminoida elintarvikkeita sekä maaperää ja
luonnonvesiä. Yleisimmät elintarvikevälitteiset tartunnanlähteet ovat pastöroimaton
maito, riittämättömästi kuumennettu liha ja saastuneella vedellä kastellut kasvikset.
Tartunnan voi saada myös saastuneesta juoma- tai uimavedestä, bakteeria erittävän
eläimen koskettamisesta, sairastuneesta henkilöstä tai oireettomasta kantajasta. (Evira
2014.) Vain 10–100 bakteeria O157:H7-serotyyppiä riittää aiheuttamaan tartunnan
(Feng, Weagant & Jinneman 2011). Itämisaika EHEC-infektioille on yleensä kolmesta
neljään päivää, mutta se voi vaihdella vuorokaudesta 16 päivään. Suurin osa
sairastuneista paranee 10 päivässä. EHEC-infektion saanut aikuinen erittää bakteeria
ulosteeseen yleensä noin viikon ja lapsi yhdestä kolmeen viikkoa. EHEC voi kehittyä
henkeä uhkaavaksi pienille lapsille ja vanhuksille. (WHO 2011; Center for Food Security
and Public Health 2009.)
EHEC-tartunnan oireita ovat vetinen ripuli ja vatsan kouristukset. Osa potilaista voi
kärsiä lämmönnoususta ja oksentelusta. Joissain tapauksissa voi kehittyä hemorraginen
koliitti, jossa potilas kärsii verisestä ripulista sekä kovista vatsan kouristuksista. Infektio
voi esiintyä oireettomana etenkin aikuisilla. (WHO 2011; Center for Food Security and
Public Health 2009; THL 2013.)
Jopa 10 % EHEC-infektiota sairastavista ja 16 % henkilöistä, joilla esiintyy hemorragista
koliittia, esiintyy myös hemolyyttis-ureemista oireyhtymää (HUS). Muita suurempi riski
sairastua on lapsilla, vanhuksilla ja henkilöillä, joilla on immuunipuutos. Hemolyyttisureeminen oireyhtymä aiheuttaa sairastuneille henkilöille vaihtelevissa määrin kaikki tai
osan sille tyypillisistä piirteistä: munuaisten vajaatoiminta, hemolyyttinen anemia eli
punasolujen kiihtynyt hajoaminen sekä trombosytopenia eli verihiutaleiden määrän
aleneminen. Potilailla esiintyy myös keskushermosto-oireita kuten uneliaisuutta ja
ärtyneisyyttä. Joillain potilailla havaitaan haimatulehdus tai haima-arvojen kohoamista.
Vakavimmissa tapauksissa halvaukset, aivojen turvotus, aivohalvaukset sekä tajuttomuus
ovat
mahdollisia.
tromboottista
Hemolyyttis-ureeminen
trombosytopeenistä
oireyhtymä
purppuraa
(TTP).
voi
muistuttaa
Kuolleisuus
suuresti
hemolyyttis-
ureemisessa oireyhtymässä on 3–5 %. (WHO 2011; Center for Food Security and Public
Health 2009.)
10
EHEC:n hoidossa ei käytetä antibiootteja, koska niiden käytön seurauksena kuolleista
bakteereista vapautuu toksiinia. Antibiootit eivät vähennä oireita tai komplikaatioita ja
niiden käyttö voi kasvattaa riskiä myöhemmin puhkeavaan hemolyyttis-ureemiseen
oireyhtymään. Hemorragista koliittia hoidetaan tukihoidoilla, kuten nesteytyksellä ja
elektrolyyttitasapainon ylläpitämisellä. Hemolyyttis-ureeminen oireyhtymä vaatii
sairaalahoitoa. (WHO 2011; Center for Food Security and Public Health 2009; THL
2013; Goldwater & Bettelheim 2012.)
2.3
Shiga-toksiinia tuottavan E. coli -bakteerin tunnistus
Fimlab Laboratoriot Oy käyttää EHEC-diagnostiikassa ulosteviljelyä, serotyypitystä ja
toksiinin
osoitusta.
Ulosteviljelyssä
käytetään
MacConkey-sorbitolimaljaa
ja
MacConkey-putkea, joita kasvatetaan yön yli lämpöhuoneessa. Toksiiniosoitus tehdään
mahdollisesta sauvabakteerikasvustosta maljalta. Jos maljalla ei kasva sauvabakteeria,
viljellään MacConkey-putkesta uusi malja. Jos tällä toisella maljalla kasvavaa
sauvabakteeri, tehdään siitä toksiinitesti. Jos kummallakaan maljalla ei kasva
sauvabakteereja, on näyte negatiivinen. Negatiivisia maljoja kasvatetaan vielä
vuorokausi, jonka jälkeen ne luetaan uudelleen. Jos toksiinitesti on negatiivinen, on näyte
negatiivinen. (Fimlab Laboratoriot Oy, 2014a.)
Toksiiniosoitustesti on immunokromatografinen pikatesti, joka erottelee toisistaan Shigatoksiinit 1 ja 2. Testissä käytetään monoklonaalisia, värjättyjä vasta-aineita. MacConkeymaljalta siirrostetaan bakteeria polymyksiini B -liuokseen, jota pipetoidaan testikasettiin.
Tulos on positiivinen, kun sekä kontrolliviiva että toinen tai molemmat toksiinia
osoittavista viivoista ovat näkyvissä. Positiivisesta näytteestä tehdään puhdasviljelmä,
josta toksiinitestin tulos varmistetaan. Lisäksi näyte tunnistetaan Vitek Maldi-TOF MS laitteella. Positiivisen toksiinitestin jälkeen tehdään myös E. coli O157 latex -testi, jolla
voidaan
osoittaa
mahdollinen
O157-seroryhmä.
Se
perustuu
O157-kantojen
agglutinaatioon testilateksin kanssa. Kaikki Shiga-toksiinia tuottavia E. coli -kantoja ei
voida löytää tällä testillä. Positiivisista tuloksista tehdään herkkyysmääritys ja kanta
lähetetään varmistettavaksi Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen (THL) laboratorioon.
(Fimlab Laboratoriot Oy 2014a; Fimlab Laboratoriot Oy 2014b.)
11
Syy, miksi Fimlab Laboratoriot Oy on ottamassa käyttöön PCR-menetelmää, on nykyisen
menetelmän hitaus ja monivaiheisuus. Viljely vaatii vähintään päivän kasvaakseen ja
toksiiniosoituksessa näytteessä täytyy olla paljon toksiinia tuottavia bakteereita, jotta se
tunnistaa toksiinin eli sen sensitiivisyys on heikko. (Hirvonen 2014.)
Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen Bakteeri-infektiot-yksikköön lähetetään kaikki
uusista EHEC-infektioista eristetyt kannat (THL 2015e). Kannat lähetetään edelleen
tartuntatautirekisterin kantakokoelmaan (Jalava & Salmenlinna 2015; THL 2015d).
Kyseessä on uusi tapaus, kun näytteenottopäivämäärien välillä on yli vuosi, jos tartunta
liittyy uuteen ulkomaanmatkaan tai kannan serotyyppi eroaa aiemmasta löydöksestä
(THL 2015e). THL:n laboratoriossa tyypitetään ensisijaisesti kotimaiset STEC-kannat
(Jalava & Salmenlinna 2015). Tyypitykseen kuuluu O:H-serotyypitys, multiplex-PCR,
jolla osoitetaan stx1-, stx2-, eae-, hlyA- ja saa-geeni, kiekkomenetelmällä tehtävä
epidemiologinen
mikrobilääkeherkkyysmääritys,
pulssikenttägeelielektroforeesi
(PFGE)-genotyypitys, O157-kantojen faagityypitys sekä epidemiatilanteissa aggRgeenin PCR-osoitus (THL 2015b, THL 2015d). Tarkka tyypitys tehdään tartuntaketjun ja
epidemian lähteen selvittämiseksi. THL on osa kansainvälistä EPIS-ilmoitusjärjestelmää,
jonka kautta voidaan tiedottaa uusista epidemioista ja tutkia muiden maiden
epidemiaselvityksiä (THL 2015c).
12
3
DNA:N ERISTYS JA PUHDISTUS
Ennen PCR-ajoa nukleiinihapot on eristettävä ja puhdistettava. Eristyksessä solu ensin
hajotetaan eli lyysataan, jolloin solun sisältö vapautuu. Tämä voidaan suorittaa näytteestä
ja eristettävistä nukleiinihapoista riippuen mekaanisesti, kemikaalisesti tai biologisesti.
Näitä kolmea menetelmää voidaan myös yhdistellä. Kemikaalisessa hajotuksessa voidaan
käyttää esimerkiksi detergenttejä, jotka denaturoivat solun proteiineja ja rikkovat
lipidikalvon, tai lysotsyymientsyymejä, jotka hajottavat erityisesti gramnegatiivisten
sauvabakteerien soluseinää. Kun solut on hajotettu, voidaan tarvittaessa erottaa
kromosomaalinen ja plasmidi-DNA. Liuos neutralisoidaan, jonka jälkeen sentrifugointi
saa kromosomaalisen DNA:n painumaan pohjalle ja liuokseen jää vain plasmidi-DNA.
Kun liuosta, jossa plasmidi-DNA on, kuumakäsitellään joko keittämällä tai mikroaaltojen
avulla, saadaan nukleiinihapot irrotettua proteiineista. (Salgado & Hussain 2013, 159–
161.)
Nukleiinihappojen puhdistamiseen on useampia eri menetelmiä kuten isopropanolilla tai
etanolilla puhdistaminen, cesiumkloridi-ultrasentrifugointi tai geelisuodatus. Ominaista
puhdistusmenetelmissä on nukleiinihappojen kiinnittäminen johonkin välikappaleeseen.
Välikappale voi olla esimerkiksi liuos tai kolumni, jonka läpi puhdistettava liuos ajetaan.
Viimeisessä vaiheessa DNA eluoidaan eli puhdistettu DNA uutetaan puskuriliuokseen.
Puskuriliuos tulee valita siten, että se ei häiritse PCR-reaktiota. Ennen PCR-mittausta
liuosta voidaan säilyttää lyhytaikaisesti +4 °C -lämpötilassa tai pidempiaikaisesti
pakastettuna eikä se saa altistua UV-säteilylle, sillä se vahingoittaa nukleiinihappoja.
(Salgado & Hussain 2013, 161–166.)
13
4
POLYMERAASIKETJUREAKTIO-MENETELMÄ
Polymeraasiketjureaktio (Polymerase Chain Reaction) eli PCR on in vitro -menetelmä,
jolla monistetaan DNA-sekvenssiä käyttäen hyväksi lämpötilan vaihtelua. PCRmenetelmällä on mahdollista monistaa sekvenssiä lähes eksponentiaalisesti. PCR koostuu
eri vaiheista: denaturaatiosta, annealing-vaiheesta ja ekstensiosta eli pidennyksestä.
Nykyään PCR on automatisoitu menetelmä, mikä on osaltaan vaikuttanut sen laajaan
käyttöalueeseen. PCR-menetelmällä on laajasti käyttökohteita lääketieteessä ja
diagnostiikassa. Sitä voidaan käyttää bakteeri- ja virusinfektioiden diagnostiikkaan,
geeniekspression analysoimiseen ja sillä havaitaan ihmiselle haitalliset mutatoituneet
geenit. (Theophilus 2008, 29–30, 33–34; Kubista ym. 2006, 96–97.)
4.1
Menetelmän periaate
PCR-menetelmässä tarvitaan DNA-polymeraasi, joka kestää lämpöä. Yleisin käytetty
polymeraasi on Taq-polymeraasi, ja sille on optimoitu standardina käytetyt menetelmät.
(Suominen, Pärssinen, Haajanen & Pelkonen 2013, 153.) Taq-polymeraasientsyymin
tehtävä on templaattijuostetta peilaavan uuden juosteen kokoaminen dNTPnukleotideistä. Polymeraasin lisäksi menetelmä vaatii reaktiopuskurin, nukleotidejä,
primaareja eli alukkeita sekä monistettavan templaatin. (Theophilus 2008, 30.)
Ensimmäinen vaihe PCR:ssa on ”sulatus” eli denaturaatio, jossa lämpötilaa nostetaan,
jotta templaatin kaksijuosteisuus aukeaa. Käytetty lämpötila ja lämmitysaika riippuvat
käytettävästä templaatista. (Kubista ym. 2006, 97.) Denaturaatio voi tapahtua +94–96
°C:ssa 10–60 sekuntia (Theophilus 2008, 30). Annealing-vaiheessa alukkeet liittyvät
DNA-ketjuun halutulle pätkälle. Kun korkea lämpötila on saanut templaatin juosteet
kokonaan auki ja erilleen, lämpötilaa lasketaan, jotta oligonukleotidialukkeet kiinnittyvät
monistettavaan DNA:han. Tämä tapahtuu noin +56 °C:ssa. (Theophilus 2008, 30.)
Ekstensiossa lämpötilaa nostetaan noin +72 °C:een ja kiinnittyneiden alukkeiden
perusteella polymeraasi alkaa liittää nukleotideja templaattiin sekvenssin mukaisesti
kummankin puoleiseen nauhaan (Suominen ym. 2013, 154). Näin yhdestä DNAjuosteesta on monistunut kaksi, jotka vuorostaan uudessa syklissä denaturoidaan auki,
niihin kiinnitetään alukkeet ja liitetään nukleotidit. Jokainen uusi monistettu DNA-juoste
14
toimii templaattina seuraavassa syklissä, joten tuotetta monistuu hyvin paljon pienestä
lähtöaineksesta. (Suominen ym. 2013, 154.)
Alukkeiden valinnalla on suuri merkitys PCR-menetelmän spesifisyyteen. Valittaessa on
huomioitava
alukkeiden
komplementaarisuus,
sitoutuminen,
annealing-lämpötila
(sulamislämpötila) sekä niiden guaniini- ja sytosiinipitoisuus. (Theophilus 2008, 31.)
Guaniini ja sytosiini nostavat alukkeen sulamislämpötilaa. Jotta annealing tapahtuisi
molemmilla alukkeilla samanaikaisesti, tulee niillä olla samanlainen sulamislämpötila.
(Suominen ym. 2013, 158–159.)
PCR on sensitiivinen menetelmä, mikä saa sen alttiiksi kontaminaatioille. PCRmenetelmällä pystytään monistamaan DNA:ta jo pelkästään yksittäisestä solusta tai
DNA:ta, jota esiintyy pienessä määrin muun DNA:n joukossa. Tämä johtaa siihen, että
ulkoinen DNA helposti kontaminoi ja voi aiheuttaa väärän tuloksen. (Theophilus 2008,
29, 32.)
4.2
Multiplex-PCR
Yksi PCR:n sovelluksista on multiplex-PCR eli mPCR. Multiplex-PCR:ssa monistetaan
yhdestä näytteestä useaa eri DNA-aluetta samanaikaisesti. Teoriassa ei ole ylärajaa
kuinka montaa tuotetta monistetaan yhtäaikaisesti, mutta käytännössä on rajoittavia
tekijöitä, kuten käytetyn PCR-laitteen kapasiteetti havaita eri monistustuotteita. Myös
PCR-menetelmän optimointi jokaiselle monistustuotteelle hankaloituu, kun monistettavia
tuotteita on useita. Lisäksi epäspesifisen monistumisen riski kasvaa, kun käytetään
montaa aluketta samanaikaisesti. Monistettavat tuotteet voivat olla saman geenin eri
alueelta tai ne voivat olla toisistaan riippumattomia. (Birch, Bailey, & Anderson 2008,
167.)
4.3
Reaaliaikainen PCR
Reaaliaikainen eli real-time-PCR on PCR:n sovellus, jossa tuotteen monistusta voidaan
seurata sitä mukaa, kun sitä tuottuu. Tämä onnistuu fluoresenssia hyväksikäyttämällä,
mikä kuitenkin vaatii tähän havaitsemismetodiin suunnitellun real-time-PCR-laitteen.
15
Reaktioseokseen lisätään väriaine eli fluoresoiva merkkiaine, joka kiinnittyy DNA:han.
Fluoresenssin eksitaatiossa huomataan monistuneeseen kaksijuosteiseen DNA:han
kiinnittynyt väri. (Theophilus 2008, 38.)
Reaaliaikainen PCR on menetelmänä parantanut infektioiden diagnostiikkaa ja sen käyttö
on levinnyt laajalle eri mikrobiologian osa-alueille. Väärien positiivisten tulosten riski on
vähentynyt reaaliaikaisella PCR:lla, koska monistettua tuotetta ei tarvitse enää käsitellä
eikä reaaliaikaisessa PCR:ssa käytettyjen suljettujen putkien välillä monistustuote pääse
siirtymään näytteestä toiseen. (Sails 2013, 123.)
Käytettävät merkkiaineet voivat toimia joko sekvenssille spesifisesti tai epäspesifisti.
Spesifissä menetelmässä väriaine on koettimessa, jonka perustuksena toimivat
nukleiinihapot tai sen synteettiset vastineet kuten peptidinukleiinihapot. Fluorofori eli
fluoresoiva väriaine joko on itsestään voimakkaasti fluoresoiva, mutta sen on fluoresenssi
vaimennettu sammuttajamolekyylillä, tai se alkaa fluoresoida vasta kiinnityttyään
DNA:han.
Muun
muassa
hydrolyysikoettimet
perustuvat
fluoroforin
ja
sammuttajamolekyylin yhdistelmään. Hydrolyysikoettimen toisessa päässä on fluorofori
ja
toisessa
sammuttaja.
Koetin
liittyy
monistettavaan
DNA-alueeseen
ja
ekstensiovaiheessa polymeraasi katkaisee koettimen, mikä erottaa fluoroforin
sammuttajamolekyylistä. Tämä mahdollistaa sen, että PCR-laite voi havaita
fluoresenssin. Väriaineita on saatavilla monipuolisesti, mikä mahdollistaa useiden eri
taudinaiheuttajien
yhtäaikaisen
tutkimisen
multiplex-menetelmissä.
Multiplex-
menetelmät käyttävät koettimia merkkiaineissa, jotta useaa eri monistustuotetta voidaan
määrittää
rinnan.
Tällöin
on
huomioitava
käytettävien
värien
mahdolliset
päällekkäisyydet aallonpituuksissa, mikä tekisi niiden erottamisen ja täten myös eri
monistustuotteiden erottamisen toisistaan hankalaksi. Epäspesifissä menetelmässä
merkkiaine on väri, joka kiinnittyy DNA:han ja muuttuu fluoresoivaksi. Monistetun
DNA:n määrä ja fluoresenssin määrä värissä eivät ole yksi yhteen, mutta fluoresenssi
kasvaa kaksijuosteisen DNA:n monistuessa. (Kubista ym. 2006, 102–106; R-Biopharm
AG 2013, 3; Sails 2013, 124.)
Reaaliaikainen PCR -menetelmä muodostaa käyrän, josta ilmenee fluoresenssin kasvu
syklien edetessä. Käyrä (kuva 1) koostuu kolmesta vaiheesta: alun peruslinja, missä
havaitaan vain taustafluoresenssia, toinen vaihe, jossa tuotteen monistumisen
aikaansaama
fluoresenssi
ylittää
peruslinjan
ja
monistuminen
muuttuu
16
eksponentiaaliseksi, sekä kolmas vaihe, jossa reagenssit ehtyvät, monistuminen hidastuu
ja käyrä tasaantuu. (Karlen ym. 2007.) Reaaliaikaisissa menetelmissä käytössä on
käyrälle asetettava threshold eli kynnystaso, joka on määritetty taustafluoresenssin
muodostaman peruslinjan yläpuolelle, mutta kuitenkin käyrän eksponentiaalisen vaiheen
kohdille. Thresholdin ja monistuskäyrän risteyskohta kertoo kynnyssyklin (Ct), jonka
perusteella voidaan halutessa laskea monistustuotteen lähtökonsentraatio. (Life
Technologies Corporation 2011.)
KUVA 1. Reaaliaikainen PCR -kuvaaja. (Karlen ym. 2007, muokattu)
PCR-laitteita on nykyään saatavilla laaja-alaisesti. Reaaliaikaiset PCR -laitteet ovat
kehittyneet paljon 1990-luvun puolivälistä, jolloin niitä tuli ensi kertaa kaupallisesti
tarjolle. Nykyään laitteiden syklit ovat nopeita ja multiplex-menetelmissä yhä useampia
geenejä voidaan tutkia samanaikaisesti. Rotor-Gene® on yksi käytetyimmistä laitteista.
Muita ovat mm. Light Cycler ja TaqMan 7000. (Sails 2013, 124–125.)
17
5
MENETELMIEN VALIDOINTI KLIINISESSÄ LABORATORIOSSA
Saatujen laboratoriotulosten laatuun vaikuttavat kokonaisuutena näyte, käytetty
menetelmä ja laite, näytteen analysoija sekä analysointiympäristö. Saatujen tulosten on
oltava luotettavia ja laboratorion on huolehdittava tuottamiensa tulosta laadukkuudesta ja
toimintansa kehittämisestä. (Jaarinen & Niiranen 2005, 8.)
Uutta menetelmää otettaessa käyttöön on tärkeää, että se toimii todistettavasti.
Validoinnilla varmistutaan tulosten oikeellisuudesta. Jos käyttöönotettava tutkimus
korvaa aiemmin käytössä olleen toisen menetelmän, tulee menetelmien tulosten
yhdenmukaisuutta vertailla.
Validoinnissa on
otettava huomioon
suhteellinen
oikeellisuus, toistettavuus, sensitiivisyys ja spesifisyys sekä menetelmän toteamisraja.
(Hallanvuo 2010.) Suhteellinen oikeellisuus kertoo menetelmän vastaavuudesta
referenssimenetelmään. Herkkyys eli sensitiivisyys kuvaa menetelmän kykyä havaita
pienetkin pitoisuusvaihtelut määritettävää ainetta. Tämä voidaan esittää saatujen
positiivisten tulosten osuutena tai oikeiden positiivisten tulosten suhteena oikeisiin
positiivisiin ja vääriin negatiivisiin tuloksiin. Spesifisyys on menetelmän kyky määrittää
vain analysoitavaa ainetta muiden häiritsemättä. Se voidaan kuvata oikeiden negatiivisten
tulosten suhteena oikeisiin negatiivisiin ja vääriin positiivisiin tuloksiin. Toteamisraja on
pienin mahdollinen pitoisuus mikrobeja, minkä menetelmä havaitsee luotettavasti. (Evira
1997; Lalkhen & McCluskey 2008.)
Laatua
kliinisessä
laboratorioissa
valvotaan
erilaisten
standardien
pohjalta.
Kansainväliset standardit vahvistetaan suomalaisiksi kansallisiksi standardeiksi.
Standardi SFS-EN ISO 15189 kuvaa laboratorioiden laatu- ja pätevyysvaatimuksia ja se
edellyttää laboratoriolta käytetyille menetelmille riittävän kattavia validointeja niiden
soveltuvuuden varmistamiseksi. Validoinnin tuottamat tulokset ja sen aikana suoritetut
menettelyt tulee arkistoida ja säilyttää. (Suomen standardisoimisliitto SFS 2003, 1, 8, 46;
Tarkka 2007.) Myös standardissa SFS-EN ISO/IEC 17025 tuodaan esiin validointi. Siinä
kerrotaan eri tekniikoista, joita tai joiden yhdistelmiä menetelmää validoidessa tulisi
käyttää. Näitä tekniikoita ovat: kalibrointi referenssimenetelmiä hyödyntäen, eri
menetelmällä saatujen tulosten tai toisen laboratorioiden tulosten vertailu sekä tulokseen
vaikuttavien ja tulokseen epävarmuutta aiheuttavien tekijöiden arviointi. (Suomen
standardisoimisliitto SFS 2005, 36.)
18
Validoinnista kirjoitetaan validointiraportti, johon kirjataan validoinnissa läpi käytävät
vaiheet, suoritetut mittaukset sekä niistä tehdyt johtopäätökset. Se pitää sisällään
menetelmän soveltuvuuden kyseiseen määritykseen sekä luotettavuuden arvioinnin.
Menettelyt laadunvarmistukselle kehitetään validoinnin ohessa ja validoinnin tuloksista
luodaan
menetelmäohje,
joka
varmistaa
menetelmän
analyysitoiminnassa. (Jaarinen & Niiranen 2005, 14–15.)
luotettavuuden
19
6
TAVOITE, TARKOITUS JA TEHTÄVÄT
Fimlab Laboratoriot Oy on ottamassa käyttöön PCR-menetelmää Shiga-toksiinia
tuottavan E. coli -bakteerin tunnistamiseksi. Tunnistamiseen käytetään kaupallista
RIDA®GENE STEC -tutkimuspakkausta ja Rotor-Gene® Q MDx -laitetta. Tämän
tutkimuksen tavoitteena on tuottaa tietoa tutkimuspakkauksen toimivuudesta menetelmän
käyttöönottamiseksi. Kokeellisen osuuden tulosten pohjalta Fimlab Laboratoriot Oy
jatkaa menetelmän validoimista ja käyttöönottamista.
Tarkoituksemme on tuottaa menetelmällä analyysituloksia, joiden perusteella voidaan
määrittää sensitiivisyys ja spesifisyys. Analysoimme eristettyjä bakteerikantoja,
keinotekoisia
potilasnäytteitä
sekä
laimennossarjan
käyttöönotettavalla
PCR-
menetelmällä. Menetelmän kyky tunnistaa positiiviset ja negatiiviset näytteet kertoo
menetelmän spesifisyydestä. Sensitiivisyys saadaan selville laimennossarjan avulla ja
saatuja tuloksia verrataan valmistaja ilmoittamaan havaitsemisrajaan.
Opinnäytetyömme tehtävät ovat:
1. Mikä on menetelmän spesifisyys?
2. Mikä on menetelmän sensitiivisyys?
3. Kuinka hyvin käyttöönotettava menetelmä soveltuu Shiga-toksiinia tuottavan E.
coli -bakteerin tunnistamiseen?
20
7
OPINNÄYTETYÖN MENETELMÄ
Opinnäytetyömme on kvantitatiivinen tutkimus. Kvantitatiiviselle tutkimukselle
tyypillistä on syy-seuraus-suhteen tarkastelu, aiempaan tutkimustietoon perustuva
teoriapohja sekä tutkimuksen avulla saadun aineiston tilastollinen analysointi ja
taulukointi. Kvantitatiivinen tutkimus usein pohjautuu aiempiin teorioihin ja
tutkimuksiin. Kvantitatiiviseen tutkimukseen liittyy aineiston mittaaminen ja tulosten
esittäminen lukuarvoina. (Hirsjärvi, Remes & Sajavaara 2009, 139–140.) Tutkimuksesta
saatujen analyysitulosten pohjalta voidaan arvioida PCR-menetelmän luotettavuutta ja
tulosten oikeellisuutta sekä suorittaa menetelmän validointi.
PCR-menetelmän toimivuutta tutkitaan erilaisilla näytteillä kuten kantakokoelmien
näytteillä ja laimennossarjalla. Käytetty otanta koostuu Fimlab Laboratoriot Oy:n 34
kontrollikannasta
sekä
Terveyden
ja
hyvinvoinnin
laitokselta
saaduista
11
bakteerikannasta. Yhteensä tutkittuja bakteerikantoja on 45, joista STEC-positiivisia on
13. Tutkitussa otannassa on laajasti eri STEC-negatiivisia bakteereja sekä bakteereja,
jotka tuottavat Shiga-toksiinia 1, 2 tai molempia.
Saatuja tuloksia verrataan tutkimuspakkauksen valmistajan ilmoittamiin tietoihin sen
toimivuudesta. Valmistajan lupaamaa herkkyyttä tutkitaan laimennossarjan avulla.
Ennalta tunnettujen bakteerikantojen perusteella nähdään, kuinka hyvin PCR-menetelmä
havaitsee positiiviset ja negatiiviset näytteet.
21
8
OPINNÄYTETYÖPROSESSI
Opinnäytetyön aiheen valintaan vaikuttivat kiinnostus molekyyli- ja mikrobiologiaan.
Lisäksi on haluttu tehdä käytännönläheinen työ, jonka käytännön osuus suoritetaan
laboratoriossa. Työn haluttiin myös hyödyttävän työelämää. PCR on menetelmänä
mielenkiintoinen ja sen käyttö yleistyy nopeasti.
Opinnäytetyön aihe valittiin syyskuussa 2014. Työelämän yhdyshenkilöön oltiin
yhteydessä sähköpostitse syyskuun 2014 aikana. Tapaaminen Fimlab Laboratoriot Oy:ssä
sovittiin lokakuun 2014 alkuun, jolloin opinnäytetyön rajaus tarkentui ja saatiin aiheeseen
liittyvää materiaalia. Syyskuun ja lokakuun aikana kirjoitettiin opinnäytetyösuunnitelma,
joka esitettiin suunnitelmaseminaarissa. Lupahakemus hyväksyttiin joulukuussa.
Käytännön osuus suoritettiin 12.–19.12.2014. Alussa tehtiin aikataulu, jossa tutkimus
jaettiin sopiviin osiin eri päiville. Ensimmäisinä päivinä näytteet kerättiin ja esikäsiteltiin.
Laboratorio-osuuden loppupuolella suoritettiin PCR-analyysit. Käytännön osuuden
jälkeen työelämän yhdyshenkilöön oltiin yhteydessä tarvittaessa. Kirjallisen työn
lähdemateriaalia etsittiin kesällä 2015 ja opinnäytetyö kirjoitettiin kesän ja syksyn aikana.
Lähteiksi valikoitiin kirjallisuutta, reagenssi- ja laitevalmistajan ohjeita, Terveyden ja
hyvinvoinnin laitoksen ja Maailman terveysjärjestön artikkeleita ja tilastoja sekä
tieteellisiä artikkeleita.
22
9
KÄYTÄNNÖN SUORITUS
Näytemateriaali koostui Fimlab Laboratoriot Oy:n 34 eri bakteerikannasta, THL:n 11
kannasta,
neljän
laimennoksen
laimennossarjasta
ja
kahdesta
keinotekoisesta
potilasnäytteestä. Fimlab Laboratoriot Oy:n bakteerikannan olivat maljoille viljeltyjä
tunnettuja kontrollikantoja, joista eristettiin DNA kohdassa ”9.3 DNA:n eristys” esitetyllä
tavalla. Kannat on listattu liitteessä 1. Niiden joukossa oli kaksi STEC-positiivista E. coli
-kantaa. Liitteessä 2 on THL:ltä tilatut 11 valmiiksi eristettyä kantaa, joiden kaikkien
oletettiin olevan STEC-positiivisia. THL:lta oli tilattu kantoja, koska Fimlab Laboratoriot
Oy:llä oli vain kaksi positiivista kantaa. Fimlab Laboratoriot Oy:n tunnettuja kantoja
määritetiin, jotta saadaan tietoa menetelmän toimivuudesta. Menetelmän sensitiivisyys
määritettiin analysoimalla laimennossarja. Keinotekoisten potilasnäytteiden avulla
saadaan
tietoa
siitä,
miten
tutkimuspakkaus
ja
menetelmä
toimivat,
kun
näytemateriaalissa on useampaa kuin yhtä bakteeria. Määrityksessä käytettiin kaupallista
RIDA®GENE STEC -tutkimuspakkausta ja Rotor-Gene® Q -PCR-laitetta.
9.1
RIDA®GENE STEC -tutkimuspakkaus
RIDA®GENE STEC on reaaliaikainen PCR -menetelmä, jossa voi monistaa eri geenejä
samanaikaisesti. Se soveltuu Shiga-toksiinia tuottavan E. coli -bakteerin Shigatoksiinigeenien osoittamiseen ja tunnistamiseen. Menetelmä käyttää fluoresoivassa
merkkiaineessa hydrolyysikoettimia. (R-Biopharm AG 2013, 2–3.)
RIDA®GENE STEC -tutkimuspakkaukseen kuuluu reaktiomix, Taq-polymeraasi,
sisäinen kontrolli-DNA, PCR-vesi (negatiivinen kontrolli) ja positiivinen kontrolli.
Eristys ei kuulu tutkimuspakkaukseen, mutta valmistaja antaa esimerkkejä mahdollisista
käytettävistä kaupallisista eristysmenetelmistä. (R-Biopharm AG 2013, 3-4.) Tässä
opinnäytetyössä käytettiin Fimlab Laboratoriot Oy:n käytössä olevaa QIAGEN
QIAcube-laitteen eristysmenetelmää, joka on esitelty kohdassa ”9.3 DNA:n eristys”.
Mastermixin reagensseja säilytettiin pakkasessa ja niitä käsiteltiin vain puhdastilassa.
Reagenssit sulatettiin jokaista käyttökertaa varten. Tutkimuspakkauksen positiivinen ja
negatiivinen
kontrolli
sekä
mastermixin
sisäinen
kontrolli
säilytettiin
23
jääkaappilämpötilassa laboratoriossa. Mastermixin reaktiomix ja Taq-polymeraasi
pipetoitiin Eppendorf-putkeen puhdastilassa, jonka jälkeen siihen pipetoitiin sisäinen
kontrolli vetokaapissa. Jokaisella käyttökerralla pipetointimäärät on suhteutettava
näytteiden ja näin siis reaktioiden määrään (R-Biopharm AG 2013, 7).
Käytetty ohjelma oli tutkimuspakkauksen valmistajan ohjeiden mukainen ja Rotor-Gene®
Q:lle optimoitu. Siinä oli 45 sykliä, joissa denaturaatio kestää 10 sekuntia +95-asteessa
ja yhdistetty annealing ja ekstensio 15 sekuntia +60-asteessa (R-Biopharm AG 2013, 8).
9.2
Rotor-Gene® Q MDx -PCR-laite
Rotor-Gene® Q MDx on in vitro -diagnostiikassa käytettävä reaaliaikainen multiplexPCR -laite. Ajon aikana näytteet pyörivät 400 rpm nopeudella, mikä estää kondensaatiota
ja poistaa ilmakuplia eikä näytettä tarvitse sentrifugoida ennen ajoa. Nopeus ei ole niin
suuri, että DNA painuisi pelletiksi putken pohjaan. Kannen nikkeli-kromi-elementti
lämmittää näytekammion ja viilennysvaiheessa lämpötila lasketaan päästämällä
huoneenlämpöistä ilmaa kammioon korvaamaan kuumaa ilmaa. (QIAGEN 2014, 3-1, 51.)
Laitteessa on kuusi valonlähdettä ja kuusi detektiofiltteriä eli kuusi eri kanavaa: vihreä,
keltainen, punainen, karmiininpunainen, oranssi ja HRM (high resolution melt). Jokainen
kanava koostuu laitteen pohjassa olevasta valoa emittoivasta diodista eli LED:stä ja
eksitaatiofiltteristä, jotka saavat näytteen virittymään tietyllä aallonpituudella. Näytteestä
energia siirtyy koneen sivulla olevan emissiofiltterin läpi valomonistimeen. (QIAGEN
2014, 3-3, B-1.) Rotor-Gene® Q -laitteen optista järjestelmää havainnollistetaan kuvassa
2.
Laitteeseen liitetyltä tietokoneelta valittiin haluttu PCR-ohjelma. Näyteputket asetettiin
roottoriin, jonka päälle laitettiin lukitusrengas. Roottorin vapaille paikoille asetetiin tyhjät
putket. PCR-ohjelma käynnistetiin tietokoneelta. Ajon jälkeen käytetyt putket hävitettiin
särmäisjäteastiaan.
24
KUVA 2. Rotor-Gene® Q MDx -laitteen optinen järjestelmä. (QIAGEN 2014, 3-3,
muokattu)
9.3
DNA:n eristys
Kontrollikantojen bakteereja poimittiin maljalta suhteutettuna pesäkkeen kokoon noin
viidestä seitsemään pesäkettä, jotka siirrostettiin 150 µl Lysis Buffer -liuosta sisältäviin
Eppendorf-putkiin. Negatiivisena eristyskontrollina käytettiin 150 µl pelkkää Lysis
Buffer -liuosta. Näytesuspensioputket sekoitettiin homogeeniseksi Vortex-sekoittajalla,
minkä jälkeen ne inkuboitiin 10 minuuttia +95 °C:ssa. Näytteet sentrifugoitiin viisi
minuuttia nopeudella 13000 rpm. Jokaisesta putkesta siirrettiin 80 µl:aa supernatanttia
puhtaisiin Eppendorf-putkiin. Tämä menetelmä on nopea, mutta se ei sovellu
potilasnäytteille. Eristetty DNA säilytettiin -70 °C:ssa viikonlopun yli. Bakteerikantojen
DNA-eristykset sulatettiin ja niistä otettiin 21 kantaa, joihin sisältyi STEC-positiivinen
kontrollikanta E. coli EKO 2356/91 ja potilaskanta E. coli EE 207. THL-näytteet
saapuivat pakastettuina suspensioina. Sulatuksen jälkeen ne olivat valmiita käytettäviksi.
Keinotekoiset potilasnäytteet valmistettiin lisäämällä positiivista STEC-kantaa toiseen
kahdesta STEC-negatiivisesta ulostenäytteestä. DNA:n eristys suoritettiin laboratorion
potilasnäytteille
käytettävän
käytännön
mukaan.
Eristys
tehtiin
manuaalisesti
eristysprotokollan vaiheiden avaamiseksi, mutta normaalisti QIAGEN QIAcube -laite
25
suorittaa sen. Eppendorf-putkien pohjalle pipetoitiin 20 µl valmiiksi liuotettua
proteinaasia ja 200 µl AL-lyysispuskuria, minkä jälkeen putkia sekoitettiin Vortexsekoittimella 15 sekuntia. Näytettä pipetoitiin putkiin 200 µl. Putkia inkuboitiin +56asteessa 10 minuuttia, minkä jälkeen ne sentrifugoitiin lyhyesti E-Centrifuge-laitteella.
Lisättiin 200 µl etanolia ja sekoitettiin Vortex-sekoittimella ja sentrifugoitiin uudestaan
lyhyesti E-Centrifuge-laitteella. Saatu seos lisättiin varovasti kolumniin. Sentrifugoitiin
6000 x g (8000 rpm) yksi minuutti. Kolumni siirrettiin puhtaaseen keräysputkeen ja siihen
pipetoitiin 500 µl AW1-pesupuskuria. Putki sentrifugoitiin kuten aiemmin. Kolumni
siirrettiin puhtaaseen putkeen ja siihen pipetoitiin 500 µl AW2-pesupuskuria. Putkea
sentrifugoitiin 20000 x g (14000 rpm) kolme minuuttia. Kolumni siirrettiin puhtaaseen
Eppendorf-putkeen. Kolumniin pipetoitiin 100 µl AE-eluutiopuskuria. Inkuboitiin
huoneenlämmössä yksi minuutti ja sentrifugoitiin 6000 x g (8000 rpm) yksi minuutti.
Eppendorf-putkeen saadulle eristetylle DNA:lle suoritettiin PCR-ajo.
9.4
Laimennossarja
Shiga-toksiinia tuottavan E. coli -bakteerin PCR-testaukseen valmistettiin neljän
laimennoksen sarja. Sarjaa varten siirrostettiin tunnettua STEC-kantaa 1 ml
keittosuolaliuokseen 0,5 McFarlandin vahvuuteen. McFarland 0,5 on sameusstandardi,
joka kuvaa tiheydeltään 1x108 pesäkettä muodostavaa yksikköä (pmy) millilitrassa
(Centers for Disease Control and Prevention 1999, 72, 80). Saadusta liuoksesta 10 µl
sekoitettiin 1 ml:aan keittosuolaliuosta. Laimennokset suoritettiin kuviossa 1 olevan
kaavion mukaisesti siirtämällä aina 10 µl
tai 100 µl seuraavaan 1 ml
keittosuolaliuosputkeen. Laimennosten pitoisuudet olivat 1,5x102 pmy/ml, 7,5x103
pmy/ml, 1,5x103 pmy/ml ja 7,5x104 pmy/ml.
1,5x104 pmy/ml ja 1,5x105 pmy/ml -laimennoksista kummastakin otettiin 10 µl
suspensiota, jotka viljeltiin verimaljalle. Maljat inkuboitiin yön yli lämpökaapissa, minkä
jälkeen niistä laskettiin pesäkkeiden määrä. Tämän avulla saatiin tarkempi mikrobimäärä
kuin silmämääräisellä 0,5 McFarlandilla. Tavoitteena oli noin 150 pesäkettä ja yli 1000
pesäkettä. Maljoilta laskettiin 224 ja yli 1000 pesäkettä, minkä perusteella laimeimman
näytteen PCR-määrityksessä oli mukana 2,24 eli noin kaksi pesäkettä muodostavaa
yksikköä.
26
0,5
McFarland
1000 µl NaCl
+ 10 µl
1,5x106
pmy/µl
1000 µl
NaCl + 10 µl
1000 µl NaCl
+ 100 µl
1,5x104
pmy/µl
1,5x105
pmy/µl
10 µl
100 µl
10 µl
100 µl
1,5x102
pmy/ml
7,5x103
pmy/ml
1,5x103
pmy/ml
7,5x104
pmy/ml
Näyte D
Näyte C
Näyte B
Näyte A
KUVIO 1. Laimennossarjan pipetointikaavio.
9.5
PCR-ajon suoritus
Mastermixiä valmistettiin suhteutettuna näytteiden määrään taulukon 2 mukaan.
Mastermixiä valmistettiin pipetointivaraksi 10 % ylimäärä. Rotor-Gene® Q:n putkiin
pipetoitiin 20 µl mastermixiä ja 5 µl näytettä, jonka jälkeen putkiin laitettiin korkit.
Mukaan ajoon otettiin tutkimuspakkauksen positiivinen ja negatiivinen kontrolli sekä
negatiivinen eristyskontrolli. Näytteet ajettiin tutkimuspakkauksen valmistajan ohjeiden
mukaisella Rotor-Gene® Q:n STEC-PCR -ohjelmalla, josta kerrotaan tarkemmin
kohdassa ” 9.1 RIDA®GENE STEC -tutkimuspakkaus”. Tutkittavia näytteitä oli 51,
jotka jaettiin neljään eri ajoon.
27
TAULUKKO 2. Mastermixin pipetointimäärä. (R-Biopharm AG 2013, 7.)
Mastermix komponentit Tilavuus per reaktio 10 reaktiota (10 % ylimäärä)
Reaktiomix
19,9 µl
218,9 µl
Taq-Polymeraasi
0,1 µl
1,1 µl
Sisäinen kontrolli-DNA
1,0 µl
11,0 µl
Yhteensä
21,0 µl
231,0 µl
28
10 TULOKSET
Rotor-Gene® Q -laitteen eri kanavilla mitataan eri monistumia. Vihreällä kanavalla
havaitaan stx2-geenin monistuminen. Punaisella kanavalla havaitaan stx1-geeni. Jos
tuotetta monistuu sekä punaisella että vihreällä kanavalla, bakteeri tuottaa kumpaakin
toksiinia. Keltainen kanava havaitsee sisäisen kontrollin, joka on mukana mastermixissä.
Sisäinen kontrolli osoittaa onko näytteessä PCR:ta estävää tekijää ja onko eristys
onnistunut. Kun sekä sisäinen kontrolli että näyte monistuvat, näyte tulkitaan
positiiviseksi. Kun sisäinen kontrolli monistuu ja näyte ei monistu, näyte tulkitaan
negatiiviseksi. Jos sekä sisäinen kontrolli että näyte eivät monistu, tulkintaa ei voida tehdä
ja näyte täytyy laimentaa 1:10 PCR-vedellä. Eristys ja puhdistus voidaan myös suorittaa
uudelleen. Jos sisäinen kontrolli ei monistu ja näyte monistuu, näyte voidaan tulkita
positiiviseksi. (R-Biopharm AG 2013, 3, 11.) Monistuneet näytteet näkyvät kuvissa
thresholdin yläpuolella.
10.1 PCR-määritysten tulokset
Fimlab Laboratoriot Oy:n näytteet jaettiin kolmeen eri ajoon niiden suuren määrän
vuoksi. Samassa ajossa THL:n näytteiden kanssa mukana oli 11 Fimlab Laboratoriot
Oy:n STEC-negatiivista kantaa, jotka eivät monistuneet punaisella eivätkä vihreällä
kanavalla. Laimennossarjan kanssa samassa ajossa mukana oli yksi Fimlab Laboratoriot
Oy:n STEC-negatiivinen kanta, joka ei ollut mahtunut aiempiin ajoihin.
Ensimmäisessä ajossa tutkituista Fimlab Laboratoriot Oy:n bakteerikannoista monistui
vain tunnetut kaksi STEC-positiivista kantaa ja positiivinen kontrolli. Mikään tutkituista
bakteereista ei aiheuttanut vääriä positiivisia tuloksia. Kuvassa 3 ylimpänä on vihreä
kanava, jossa monistuvat molemmat tunnetut STEC-kannat (EKO 2356/91 ja EE 207)
sekä positiivinen kontrolli. STEC-kannat monistuivat lähes identtisesti. Positiivinen
kontrolli on monistunut myös alhaalla vasemmalla näkyvässä punaisessa kanavassa.
Alhaalla oikealla on keltainen kanava, jossa monistui sisäiset kontrollit. Yhden tunnetun
STEC-negatiivisen näytteen sisäinen kontrolli ei monistunut kunnolla.
29
KUVA 3. Ensimmäisen ajon monistuskaavio
Toisessa ajossa kaikki THL:n kannoista olivat positiivisia ja menetelmä tunnisti stx1- ja
stx2-positiiviset bakteerit. Kuvassa 4 esitetyn toisen ajon monistuskaaviossa thresholdin
eli kynnystason ylittävät käyrät ovat THL:n näytteitä. Vain vihreällä kanavalla monistui
viisi THL:n kantaa. Vain punaisella kanavalla monistui kolme kantaa. Sekä punaisella
että vihreällä kanavalla monistui kolme kantaa. Keltaisella kanavalla monistuivat sisäiset
kontrollit.
KUVA 4. Toisen ajon monistuskaavio.
Laimennos suoritettiin tunnetusta STEC-kannasta (EKO 2356/91), joka monistuu vain
vihreällä
kanavalla
(kuva
5).
Ajoon
sisällytettiin
jokaisesta
laimennoksesta
rinnakkaisnäyte. Näytteiden monistuskäyrät olivat yhtenevät ja laimennossarjan
laimeinkin näyte monistui. Näytteet monistuivat suhteessa niiden bakteeripitoisuuteen:
vahvin A eniten ja laimein D vähiten.
30
KUVA 5. Laimennossarjan monistuskaavio.
Keinotekoisista potilasnäytteistä A oli STEC-positiivinen ja B STEC-negatiivinen. Näyte
A, eli sininen käyrä, monistui vihreällä kanavalla ja näyte B, eli violetti käyrä, ei
monistunut kummallakaan (kuva 6). Positiivinen kontrolli monistui vihreällä ja punaisella
kanavalla ja sisäiset kontrollit keltaisella.
KUVA 6. Keinotekoisten potilasnäytteiden monistuskaavio.
31
10.2 Tulosten yhteenveto
Menetelmällä suoritettiin neljä PCR-ajoa, joissa analysoitiin yhteensä 51 bakteeria
sisältävää näytettä. Menetelmä havaitsi jokaisen tunnetun STEC-positiivisen näytteen
eikä vääriä positiivisia tuloksia saatu. Threshold asetettiin niin, että positiiviset näytteet
jäivät sen yläpuolelle ja negatiiviset alapuolelle. Thesholdin paikka ei ole merkitsevä,
koska ei ollut tarvetta selvittää näytteen lähtökonsentraatiota.
Fimlab Laboratoriot Oy:n bakteerikannat olivat kaikki tunnettuja ja suoraan maljoilta
siirrostettuja. THL:n kannat tiedettiin positiivisiksi, mutta etukäteen ei tiedetty mitä
toksiinia ne tuottavat. Tutkituista Fimlab Laboratoriot Oy:n bakteereista kaksi oli STECpositiivista ja muut 32 STEC-negatiivisia. Saadut tulokset vastasivat odotuksia.
Taulukossa 3 on esitetty kantakokoelmanäytteiden tulokset. Yhdessä ajossa kaksi
tunnetusti STEC-negatiivista näytettä (kuva 4) ja yhden näytteen sisäinen kontrolli (kuva
3) monistuivat heikosti tuntemattomasta syystä. Potilasnäytteiden kohdalla ne olisi voitu
ajaa uudelleen, mutta tässä yhteydessä sitä ei koettu tarpeelliseksi, koska kokeelliseen
osuuteen valittu otos oli laaja eivätkä heikosti monistuneiden tunnettujen negatiivisten
monistuskäyrät olleet yhteneviä tunnettujen positiivisten näytteiden käyrien kanssa.
Näytettä, jonka sisäinen kontrolli monistui heikosti, ei ole huomioitu tulostaulukossa
(taulukko 3), koska tulkintaa ei voida tehdä monistumattoman kontrollin vuoksi.
TAULUKKO 3. Kantakokoelmanäytteiden tulokset.
Tunnetut positiiviset
Tunnetut negatiiviset
Yhteensä
näytteet
näytteet
Positiivisia, joista:
13
0
13
stx1
3
0
3
stx2
7
0
7
stx1 ja stx2
3
0
3
Negatiivisia
0
31
31
Yhteensä
13
31
44
Keinotekoisista potilasnäytteistä ei etukäteen tiedetty onko niissä STEC-positiivista
bakteeria vai ei. Näytteessä A monistui Shiga-toksiinia ja näyte B oli negatiivinen.
32
Näytteet valmistanut mikrobiologi vahvisti tulokset oikeiksi. Näytemateriaalissa mukana
olleet muut bakteerit eivät häirinneet analyysiä, mikä kertoo menetelmän spesifisyydestä.
Laimennossarjasta viljeltiin näytemateriaalia verimaljoille, jotta saatiin tietää tarkempi
bakteeripitoisuus kuin pelkän silmämääräisesti arvioidun 0,5 McFarland-standardin
perusteella. Viljelyistä laskettujen pesäkkeiden perusteella laimennokset olivat tarpeeksi
tarkkoja. Sarjan laimeimman näytteen ajossa oli mukana verimaljalta lasketun tarkemman
pitoisuuden mukaan noin kaksi pesäkettä muodostavaa yksikköä ja valmistaja ilmoittaa
testipakkauksen ohjeessa havaitsemisrajaksi viisi pesäkettä muodostavaa yksikköä.
Laimennossarjan näytteet monistuivat odotetusti eli eninten bakteeria sisältävä näyte
monistui eniten ja laimein vähiten. Kuitenkin sarjan jokainen näyte oli selvästi
positiivinen. Tämän perusteella menetelmä on sensitiivisyydeltään hyvä.
33
11 POHDINTA
Opinnäytetyön tarkoituksena oli selvittää RIDA®GENE STEC -tutkimuspakkaukseen
perustuvan PCR-menetelmän sensitiivisyys ja spesifisyys analysoimalla sillä erilaisia
bakteerikantoja. Tehtävinä oli selvittää kuinka hyvä PCR-menetelmän sensitiivisyys ja
spesifisyys on ja sen soveltuvuus Shiga-toksiinia tuottavan E. coli -bakteerin
tunnistamiseen. Tavoitteena oli tuottaa tietoa tutkimuspakkauksen toimivuudesta
menetelmän käyttöönottoa varten.
Menetelmä tunnisti hyvin STEC-positiiviset näytteet eikä tuottanut vääriä positiivisia
tuloksia. Keinotekoisten potilasnäytteiden muut bakteerit eivät häirinneet määritystä.
Tästä voidaan päätellä, että menetelmän spesifisyys on hyvä. Sensitiivisyyden
määritykseen käytetyn laimennossarjan laimeimmassa näytteessä oli vähemmän
pesäkettä muodostavia yksiköitä kuin mitä valmistaja ilmoittaa havaitsemisrajaksi.
Laimeimman näytteen monistuminen todistaa, että menetelmän sensitiivisyys on
tarpeeksi korkea. Laimennossarja olisi voinut olla laimeampi, mutta saatujen tulosten
perusteella menetelmä on käyttötarkoitukseensa riittävän herkkä. Näiden tulosten
perusteella
menetelmä
soveltuu
Shiga-toksiinia
tuottavan
E.
coli
-bakteerin
tunnistamiseen ja myös kokeellisesta osuudesta vastannut mikrobiologi totesi
menetelmän toimivuuden riittäväksi.
Opinnäytetyön tavoitteet täyttyivät. Saadut tulokset olivat käyttökelpoisia ja niiden
pohjalta Fimlab Laboratoriot Oy voi jatkaa menetelmän käyttöönottoa. Kokeellisen
osuuden jälkeen PCR-menetelmää alettiin käyttää rinnan viljelyn ja serotyypityksen
kanssa, mikä antaa tietoa menetelmän toimivuudesta ja mahdollistaa menetelmien
vertailun. Näytteiden määrittämistä rinnakkain kahdella menetelmällä jatketaan kunnes
on saatu tarpeeksi vertailutietoa.
Käytännön osuudessa luotettavuuteen ja laatuun kiinnitettiin paljon huomiota. PCRajossa käytettiin mukana aina tutkimuspakkauksen omaa positiivista ja negatiivista
kontrollia ja mastermixiin lisättiin sisäinen kontrolli. Lisäksi ensimmäisessä ajossa
mukana oli myös negatiivinen eristyskontrolli. Eristyskontrollia käytetään antamaan
tietoa eristyksen onnistumisesta ja mahdollisesta kontaminaatiosta. Sisäinen kontrolli
osoittaa onko näytteessä PCR:ta estävää tekijää. Kaikki positiiviset kontrollit olivat
34
selkeästi positiivisia, kaikki negatiiviset olivat negatiivisia ja sisäinen kontrolli monistui,
mikä puhuu tulosten oikeellisuuden puolesta. Oikein monistunut tuote kertoo, että
mastermix oli valmistettu oikein sekä siitä, että suoritettu eristys oli onnistunut.
Koko kokeellisen osuuden aikana työskenneltiin minimoiden kontaminaatioriski.
Mastermix pipetoitiin puhdastilassa, jossa aseptiikkaan kiinnitettiin erityistä huomiota.
Pipetoidessa
toimittiin
huolellisesti,
jotta
näytettä
ei
pääse
roiskumaan
ja
kontaminoimaan muita näytteitä tai työtiloja. Huolellisuus oli tärkeää myös sen takia, että
ajoittain pipetoitavat määrät olivat todella pieniä. Näytteet olivat tarkkaan identifioituja,
jotta näytteet eivät päässeet vaihtumaan tai sekoittumaan keskenään.
Opinnäytetyöprosessi on pyritty suorittamaan luotettavasti ja eettisten lähtökohtien
mukaisesti.
Opinnäytetyön
luotettavuus
on
pyritty varmistamaan
käyttämällä
mahdollisimman ajankohtaisia ja tuoreita lähteitä ja monipuolisesti erilaisia
lähdemateriaaleja. Vanhemmat lähteet pyrittiin yhdistämään tuoreempaan materiaaliin ja
asiasisältöjen paikkansapitävyys tarkistettiin. Lähteet on merkitty asianmukaisesti
lähdemateriaalia kunnioittaen. Myös raportoinnin yksityiskohtaisuuteen on kiinnitetty
huomiota. Käytetyt bakteerikannat olivat kontrollikantoja, joissa ei ollut mukana
potilastietoja.
Opinnäytetyön käytännön osuus oli onnistunut. Työskentely laboratoriossa oli
ammattimaista ja työt etenivät suunnitelman mukaisesti. Seurasimme ohjeita ja
pyysimme tarvittaessa neuvoja työelämän yhdyshenkilöltä. Kuitenkin teoreettisen taustan
kokoaminen aloitettiin liian myöhään ja siten kirjoitustyö viivästyi. Tämän takia
opinnäytetyöprosessi ei pysynyt täysin aikataulussa. Opinnäytetyön teoriapohjan
kirjoittamiseen ja työn viimeistelyyn olisi voitu varata enemmän aikaa. Vaikka
työskentelyssä oli kehitettävää, opinnäytetyön raportti valmistui määräajassa eikä
aikataulun venymisellä ollut suuria vaikutuksia lopputulokseen. Opinnäytetyöprosessin
aikana opimme uuden menetelmän käyttöönotosta ja sen vaatimuksista sekä
suunnitelmallisuuden tärkeydestä. Saimme myös paljon käytännön kokemusta
laboratoriossa toimimisesta. Opimme paljon esimerkiksi puhdastilassa työskentelystä
sekä mikrobiologisten bakteerikantojen käsittelystä.
Tutkimus jatkuu Fimlab Laboratoriot Oy:n puolesta. Ehdotukset jatkotutkimusaiheiksi
ovat
laimeamman
laimennossarjan
valmistaminen
ja
tarkemman
herkkyyden
35
määrittäminen, mikä tarjoaisi lisää tietoa menetelmän toimivuudesta, sekä eri
valmistajien STEC PCR -menetelmien vertaileminen.
36
LÄHTEET
Birch, L., Bailey, C., & Anderson M. 2008. Multiplex PCR and Whole Genome
Amplification. Teoksessa Keer, J. & Birch, L. 2008. Essentials of nucleic acid analysis:
a robust approach. Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry.
Canadian Centre for Occupational Health and Safety. 2013. What is a LD 50 and LC 50 ?
Government of Canada. Luettu 17.9.2015.
http://www.ccohs.ca/oshanswers/chemicals/ld50.html
Centers for Disease Control and Prevention. 1999. Laboratory Methods for the Diagnosis
of Epidemic Dysentery and Cholera. Atlanta, Georgia: CDC.
Center for Food Security and Public Health. 2009. Enterohemorrhagic Escherichia coli
Infections. Luettu 26.9.2015.
http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/e_coli.pdf
Coburn, B., Sekivor, I. & Finlay, B. B. 2007. Type III Secretion Systems and Disease.
Clinical Microbiology Reviews. Luettu 27.9.2015.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2176049/
Evira. 1997. Mikrobiologisten menetelmien validointiohje. 13/1997. Luettu 13.9.2015.
http://www.evira.fi/files/attachments/fi/evira/lomakkeet_ja_ohjeet/elintarvikkeet/elintar
vike_ja_rehututkimus/mibi/validointiohje_13_1997.pdf
Evira. 2014. Escherichia coli / EHEC (VTEC/STEC) ruokamyrkytysten aiheuttajana.
http://www.evira.fi/portal/fi/elintarvikkeet/tietoa+elintarvikkeista/elintarvikevaarat/ruok
amyrkytykset/ruokamyrkytyksia+aiheuttavia+bakteereja/escherichia+coli/
Feng, P., Weagant, S. & Jinneman, K. 2011. Diarrheagenic Escherichia coli.
Bacteriological Analytical Manual. U. S. Food and Drug Administration. Päivitetty
7/2014. Luettu 28.9.2015.
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070080.htm
Fimlab laboratoritot Oy. 2014a. E. coli, enterohemorrhaginen. Työohje.
Fimlab laboratoritot Oy. 2014b. E. coli, enterohemorrhaginen, toksiini. Työohje
Goldwater, P. & Bettelheim, K. 2012. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli
(EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). Luettu 26.9.2015.
http://www.biomedcentral.com/1741-7015/10/12
Hallanvuo, S. 2010. Validointi – Mikrobiologiset menetelmät. Evira. Luettu 2.9.2015.
http://www.evira.fi/files/attachments/fi/evira/esittely_toiminta_valvonta/laboratoriotoim
inta/koulutus/saija_hallanvuo_validointialustus_13102010.pdf
Hirsjärvi, S., Remes, P. & Sajavaara, E. 2009. Tutki ja kirjoita. 15. painos. Helsinki:
Tammi.
37
Hirvonen, J. mikrobiologi. 2015. Haastattelu 25.9.2015. Haastattelijat Hurskainen, I. &
Kuitunen, M. Tampere. Fimlab Laboratoriot Oy.
HUSLAB. 2013. EHEC-tutkimuksessa siirrytään nukleiinihaponosoitusmenetelmään.
Luettu 16.9.2015.
http://huslab.fi/ohjekirjan_liitteet/tutkimustiedotteet/tutkimustiedotteet_2013/2013_19_
ehec_tutkimuksessa_siirrytaan_nukleiinihaponosoitusmenetelmaan.pdf
Jaarinen, S. & Niiranen, J. 2005. Laboratorion analyysitekniikka. 5. painos. Helsinki :
Edita.
Jalava, J. & Salmenlinna, S. 2015. Bakteriologian laboratoriotoiminnan muutokset
1.1.2015. THL. Päivitetty 24.2.2015. Luettu 18.9.2015
https://www.thl.fi/fi/web/infektiotaudit/laboratoriotoiminta/asiakaskirje-toiminnanmuutokset-1.1.2015
Karlen, Y., McNair, A., Perseguers, S., Mazza, C. & Mermod, N. 2007. Statistical
significance of quantitative PCR. Luettu 17.9.2015.
http://www.biomedcentral.com/1471-2105/8/131
Kokki, M. 1998. EHEC-infektiot Suomessa. Lääketieteellinen aikakauskirja Duodecim
114 (3), 197. Luettu 20.9.2015
http://duodecimlehti.fi/web/guest/arkisto?p_p_id=Article_WAR_DL6_Articleportlet&v
iewType=viewArticle&tunnus=duo80048&_dlehtihaku_view_article_WAR_dlehtihaku
_p_auth=
Kubista, M., Andrade, J.M., Bengtsson, M., Forootan, A., Jonák, J., Lind, K., Sindelka,
R., Sjöback, R., Sjögreen, B., Sjöström, L., Ståhlberg, A. & Zoric, N. 2006. The Realtime polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine, 27/2006, 95–125. Luettu
22.8.2015. http://www.gene-quantification.de/kubista-qpcr-review-mam-2006.pdf
Lalkhen, A. & McCluskey, A. 2008. Clinical tests: sensitivity and specificity. Luettu
28.9.2015. http://ceaccp.oxfordjournals.org/content/8/6/221.full
Life Technologies Corporation. 2011. Real-time PCR: Understanding Ct. Luettu
24.9.2015.
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldoc
uments/cms_053906.pdf
Morabito, S. 2014. Foreword. Teoksessa Morabito, S. (toim.) Pathogenic Escherichia
coli. Molecular and Cellular Microbiology. Norfolk, UK: Caister Academic Press.
QIAGEN. 2014. Rotor-Gene® Q MDx User Manual (US).
R-Biopharm AG. 2013. RIDA®GENE STEC real-time PCR.
Sails, D. 2013. Applications in Clinical Microbiology. Teoksessa Lee, M. & Saunders,
N. (toim.) 2013. Real-time PCR: Advanced Technologies and Applications. Caister
Academic Press
38
Salgado, C. & Hussain W. 2013. The Extraction and Purification of Nucleic Acids for
Analysis by PCR. Teoksessa Lee, M. & Saunders, N. (toim.) 2013. Real-time PCR:
Advanced Technologies and Applications. Caister Academic Press.
Siitonen, A. & Kuusi, M. 2013. EHEC – mitä opimme Saksan vuoden 2011 epidemiasta?
Lääketieteellinen aikakauskirja Duodecim 129 (18), 1855–1857. Luettu 27.9.2015.
http://www.duodecimlehti.fi/web/guest/arkisto?p_p_id=Article_WAR_DL6_Articleport
let&p_p_action=1&p_p_state=maximized&p_p_mode=view&p_p_col_id=column1&p_p_col_count=1&viewType=viewArticle&tunnus=duo11216
Siitonen, A. & Vaara, M. 2010. Escherichia, Salmonella, Shigella ja Yersinia.
Mikrobiologia. Kustannus Oy Duodecim. Luettu 13.9.2015.
http://www.terveysportti.fi/dtk/oppi/koti?p_artikkeli=inf04495&p_selaus=15355
Smith, J., Fratamico, P. & Gunther, N. 2014. Shiga-toxin Producing Escherichia Coli.
Advances in Applied Microbiology 86, 145–197.
Suomen standardisoimisliitto SFS. 2003. SFS-EN ISO 15189. Lääketieteelliset
laboratoriot. Erityisvaatimukset laadulle ja pätevyydelle.
Suomen standardisoimisliitto SFS. 2005. SFS-EN
kalibrointilaboratorioiden pätevyys. Yleiset vaatimukset.
ISO 17025.
Testaus- ja
Suominen, I., Pärssinen, R., Haajanen, K. & Pelkonen, J. 2013. Geenitekniikka. 2. painos.
Turun ammattikorkeakoulu.
Tarkka, E. 2007. Validointi ja verifiointi kliinisen mikrobiologian laboratoriossa. Luettu
14.9.2015.
http://www.labquality.org/lq/Pdf.aspx?dir=1&path=A%29%202007%20Mblaboratorioiden%20edustajien%20kokous%2FValidointi_Eveliina_Tarkka.pdf&type=fil
e&vuosi=2014
Theophilus, B. D. M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase Chain
Reaction. Teoksessa Walker, J. M. & Rapley, R. (toim.). 2008. Molecular Biomethods
Handbook. 2. painos. Humana Press, 29–39.
THL. 2013. EHEC. Luettu 26.9.2015.
https://www.thl.fi/fi/web/infektiotaudit/taudit-ja-mikrobit/bakteeritaudit/ehec
THL. 2015a. EHEC. Tartuntatautirekisterin tilastotietokanta. Luettu 25.9.2015.
https://sampo.thl.fi/sampo_prod/cgibin/cognos.cgi?b_action=powerPlayService&ui.action=run&TARGET=%2Fcontent%2
Ffolder[%40name%3D%27amor_prod%27]%2Ffolder[%40name%3D%27ttr%27]%2Fpack
age[%40name%3D%27amor_ttr_shp_535_fi_prod%27
THL. 2015b. EHECin esiintyvyys 2014. Luettu 27.9.2015.
https://www.thl.fi/fi/web/infektiotaudit/seuranta-jaepidemiat/tartuntatautirekisteri/tartuntataudit-suomessa-vuosiraportit/tautienesiintyvyys-2014/ehecin-esiintyvyys-2014
THL. 2015c. Elintarvike- ja vesivälitteiset epidemiat 2014. Luettu 21.9.2015.
39
https://www.thl.fi/fi/web/infektiotaudit/seuranta-jaepidemiat/tartuntatautirekisteri/tartuntataudit-suomessa-vuosiraportit/tautienesiintyvyys-2014/elintarvike-ja-vesivalitteiset-epidemiat-2014
THL. 2015d. Enterohemorraginen Escherichia coli EHEC. Luettu 21.9.2015.
https://www.thl.fi/fi/web/infektiotaudit/laboratoriotoiminta/laboratoriotutkimukset/enter
ohemorraginen-escherichia-coli-ehecin-laboratoriotutkimukset
THL. 2015e. THL:n laboratoriopohjainen seuranta ja kantakokoelmaan lähetettävät bakteerikannat, 1.1.2015. Luettu 18.9.2015.
https://www.thl.fi/documents/533963/1449651/Asiakaskirjeen+liite_24+02+2015.pdf/9
2a55b53-3c7d-4830-8ba5-ae2a88c2cb96
Tortora, G., Funke, B. & Case, C. 2013. Microbiology. An introduction. 11. painos. Boston: Pearson.
Tozzoli, R. & Scheutz, F. 2014. Diarrhoeagenic Escherichia coli Infections in Humans.
Teoksessa Morabito, S. (toim.) Pathogenic Escherichia coli. Molecular and Cellular
Microbiology. Norfolk, UK: Caister Academic Press.
WHO. 2011. Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Luettu 25.9.2015.
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs125/en/
Yang, B., Feng, L., Wang, F. & Wang, L. 2015. Enterohemorrhagic Escherichia coli
senses low biotin status in the large intestine for colonization and infection. Nature
Communications. Luettu 26.9.2015.
http://www.nature.com/ncomms/2015/150320/ncomms7592/full/ncomms7592.html
40
LIITTEET
Liite 1. Siirrostetut Fimlab Laboratoriot Oy:n bakteerikannat
1 (2)
1.
Escherichia coli EKO 2356/91, EHEC O157 +
2.
Escherichia coli EE 207, EHEC +
3.
Yersinia enterocolitica EKO 2173
4.
Yersinia pseudotuberculosis EKO 2171/90
5.
Salmonella typhimurium ATCC 14028
6.
Shigella flexneri ATCC 12022
7.
Escherichia coli 2007939 oxa-48
8.
Escherichia coli EKO 7048/04 ESBL-kanta
9.
Candida albicans SKO 101/94
10.
Bacillus cereus AA9192.1/01
11.
Staphylococcus epidermis EKO 2598/92
12.
Micrococcus luteus DNA-maljan keskuskanta
13.
Staphylococcus aureus ATCC 43300
14.
Staphylococcus aureus EKO 2901/93
15.
Enterococcus faecium IH164828-9
16.
Staphylococcus aureus EKO 2820/93
17.
Enterococcus faecalis EKO 2422/91
18.
Enterococcus faecalis EKO 2423/91
19.
Plesiomonas shigelloides FF91912/98
20.
Aeromona hydrophila EKO 2549/92
21.
Acinetobacter Iwoffi WW22101/92
22.
Klebsiella pneumoniae ATCC 13833
23.
Proteus mirabilis BV11491/92
24.
Escherichia coli U56761/91
25.
Staphylococcus aureus WW01991/92
26.
Streptococcus agalactiae WW 6601/92
27.
Staphylococcus aureus ATCC 29213
28.
Escherichia coli ATCC 25922
29.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
(jatkuu)
41
2 (2)
30.
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
31.
Streptococcus pyogenes A61772/87
32.
Staphylococcus aureus ATCC 25923
33.
Enterococcus faecalis ATCC 29212
34.
Streptococcus salivarius ATCC 13419
35.
Negatiivinen kontrolli
42
Liite 2. Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen kannat
1.
THL 109399 (stx1-kanta)
2.
THL 109441 (stx2-kanta)
3.
THL 109697 (stx2-kanta)
4.
THL 110310 (stx1- ja stx2-kanta)
5.
THL 110435 (stx2-kanta)
6.
THL 110882 (stx1-kanta)
7.
THL 110758 (stx2-kanta)
8.
THL 110868 (stx1- ja stx2-kanta)
9.
THL 110922 (korkki) /110950 (putki) (stx2-kanta)
10.
THL 111235 (stx1-kanta)
11.
THL 111349 (stx1- ja stx2-kanta)
Fly UP