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Cinética celular del cáncer de mama, citometría de flujo, valor pronóstico

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Cinética celular del cáncer de mama, citometría de flujo, valor pronóstico
Cinética celular del cáncer de mama, citometría
de flujo, valor pronóstico
Miquel Sisteré Manonelles
UNIVERSITAT DE LLEIDA
FACULTAT DE MEDICINA
DEPARTAMENT DE MEDICINA ICIRURGIA
CINÉTICA CELULAR DEL
CÁNCER DE MAMA.
CITOMETRL\ DE FLUJO.
VALOR PRONOSTICO.
Miquel Sisteré i Manonelles
Prof. Dr. E. Iglesias Martínez
LLEIDA 1993.
UNIVERSITAT DE LLEIDA
Facultat de Medicina
Departament de Medicina i Cirurgia
Rovira Roure, 80
25006 Ueida
Tel. 973 -70.24.33 / 24.81.00 Ext 285
Fax. 973-24.87.54
El Dr. Edelmiro Iglesias Martínez, Professor Titular de Cirurgia de la
Facultat de Medicina de la Universitat de Lleida,
CERTIFICA : que el treball que es presenta per part de Ilicenciat Miquel
Sisteré i Manonelles , titulat "CINÉTICA CEL.LULAR DEL CÁNCER DE
MAMA. CITOMETRIA DE FLUXE. VALOR PRONÓSTIC", ha estat
realitzat sota la meva direcció i, es troba en condicions de ser llegit devant el
tribunal corresponent per tal d'optar al grau de Doctor.
Lleida, 10 dejuny de 1993
" La ciencia consisteix en substituir el saber
teoria, o sigui, per quelcom problemátic."
(Ortega y Gasset)
que semblava segur, per una
Ais meus pares per la seva gran virtut salomónica.
A la meva esposa Begoña, peí seu incondicional suport.
A la meva filia Clara, per fer-me la vida mes bonica cada dia.
AGRAIMENTS
A l Dr.
Edelmiro Iglesias i Martínez, professor t i t u l a r
de C i r u r g i a
de
de
Lleida,
la
Facultat de Medicina
Master
Barcelona,
per
en
la
Senologia
direcció,
per
de l a Universitat
1'Universitat
recolzament
i
ajut
de
en
l'elaboració d'aquesta t e s i .
Al Dr. Miquel Ángel G a l l a r t i Blanco, Hospital Arnau de
Vilanova,
Servei
d'Hematología
1
Hemoterápia,
per l e s
aportacions técniques.
Al Dr.
Xavier Gómez i Arbonés, Departament de Medicina
i C i r u r g i a de l a Facultat
Médica II (Hematología),
de Medicina de
L l e i d a , Patología
per l a desinteresada c o l . l a b o r a d o
1 suport.
A na
Inmaculada
India
1
Aldana,
Patología Quirúrgica,
F a c u l t a t de
Lleida,
en
per
l'ajut
alumna
interna de
Medicina, Universitat de
l e s tasques
de
recerca
i
de
laboratori.
Al Dr.
Josep Macla 1 V l r g i l i , Departament de
i C i r u r g i a de l a
Médica
II
Facultat de Medicina
(Hematología),
per
Medicina
de L l e i d a , Patología
facilitar
l'acces
l a b o r a t o r i d'Hematología d e l Hospital Arnau de Vilanova.
al
A na Dra.
Maria Josep Panades i Siurana, Cap de Secció
d'Anatomía Patológica
d e l Hospital
Arnau de
Vilanova, peí
suport en 1' i n t e r p r e t a d o histológica.
Al
Dr.
Julio
Ramos Ñañez,
Cap de
Servei d'Anatomía
Patológica del Hospital Arnau de Vilanova,
per f a c i l i t a r l a
recerca
aquest
del
material
emprat
en
treball
d' i n v e s t i g a d o .
Al
Dr.
Albert Sorribas i T e l l o ,
Bioesatadística,
professor t i t u l a r de
Departament de Ciencies
de l a Facultat
de
Medicina
de
Mediques Básiques
Lleida,
per l ' a j u t en l a
realització del estudi e s t a d i s t i c .
A na Roser Tamarit i O r t i ,
Quirúrgica,
Facultat
de
alumna interna de Patología
Medicina,
U n i v e r s i t a t de L l e i d a ,
per l ' a j u t en les tasques de recerca i de l a b o r a t o r i .
A na Dolors Tugues i Piqué,
Criobiologia
i
Terapia
Citometria
de
Barcelona,
per l ' i n i c i en
Fluxe.
bióloga d e l Departament de
Celular
Fluxe d e l I n s t i t u t
en
de
el
laboratori
de
Recerca Oncología de
l e s técniques
de
Citometria de
CINÉTICA CELULAR DEL
CÁNCER DE M A M A .
CITOMETRIA DE FLUJO.
VALOR PRONOSTICO.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN
Pag. 11.
A. - INCIDENCIA DEL CÁNCER DE MAMA
Pag. 11.
B. - FACTORES DE RIESGO DE PADECER DN CÁNCER
DE MA6IA
Pag. 14.
1. - Definición de f a c t o r de riesgo
Pag. 14.
2. - Factores de a l t o riesgo en e l Cáncer
de Mama
Pag. 15.
3. - Factores de riesgo medio en e l Cáncer
de Mama
Pag. 17.
4. - Factores menos asociados con e l Cáncer
de Mama
Pag. 23.
REVISIÓN DE CONCEPTOS
A. - ONCOGENESIS.
BIOLOGÍA TDMOR2VL
1. - Carcinogénesis
Pag. 26.
Pag. 26.
Pag. 27-
l a . - I n i c i o y d e s a r r o l l o de un Cáncer
en l a Mama
2. - Biología Tumoral
Pag. 29.
Pag. 33-
2a.- Generalidades
Pag. 33-
2b.- Cascada metastáslca
Pag. 34.
B. - CLASIFICACIÓN CLÍNICA DEL CÁNCER DE MAMA. .Pag. 37.
1.- TNM
Pag. 38.
l a . - Tí Referido a l tamaño d e l tumor...Pag. 39.
Ib.- N: Referido a l a afectación gang l i o n a r secundaria a l diagnóstico de un tumor en l a glándula
l e - M: Referido a l hallazgo de masa
tunKíral l e j o s d e l lugar donde se
Pag. 40.
detectó por primera vez
Pag. 40.
2. - Estadios d e l Cáncer de Mama
Pag. 43.
3. - Concepto dinámico de l a biología tumor a l . Hipótesis B i o l o g i s t a
Pag. 45.
- OTROS FACTORES PRONÓSTICOS DEL CÁNCER
DE MAMA
Pag. 49.
1. - Receptores hormonales
Pag. 49.
2. - Marcadores tunrorales
Pag. 52.
2a.- Tipos de marcadores tumorales
Pag. 54.
2b.- Interpretación de l o s resultados..Pag. 55.
2c.- Uso clínico de l o s marcadores
tximorales
Pag. 56.
2d.- Jií>licación en l a práctica clínica.Pag. 57.
3. - Factores pronósticos de t i p o
histológico
Pag. 61.
3a.- Tipo histológico d e l tumor
Pag. 61.
3b.- Grado histológico...
Pag. 62.
3c.- Tamaño tumoral
Pag. 63.
3d.- Grado nuclear
.Pag. 64.
3e-- Embolización linfática
peritumoral
3f.- Invasión
Pag. 65.
perineural
y de
vasos
sanguíneos detectada en masa
tumoral
Pag. 65.
3g.- Grado mitótico
3h.- Otros
parámetros
Pag. 66.
histológicos
de interés pronóstico
4. — Oncogenes
..Pag. 66.
.Pag. 68.
4a.- Nomenclatura
Pag. 68.
4b.- Conceptos básicos
Pag. 69.
4c.- Función de l o s oncogenes
Pag. 72.
4d.- Protooncogenes
Pag. 73.
4e.- Antioncogenes
Pag. 74.
4f.- Aplicaciones terapéuticas
Pag. 75.
D.- CICLO CELüLZkR
Pag. 78.
1. - Generalidades
Pag. 78.
2. - V a r i a b i l i d a d d e l c i c l o c e l u l a r
Pag. 83.
ESTADO DE LA CUESTIÓN
Pag. 86.
A. - CITOMETRIA DE FLUJO
Pag. 86.
1. - Generalidades
Pag. 86.
2. - Instrumental
Pag. 88.
3. - Análisis de l o s datos
Pag. 92.
4. - Ventajas y limitaciones
Pag. 93.
5. - Cuantifieación
y análisis d e l
contenido de DNA.
Estudio d e l
c i c l o celulcu:
Pag, 95.
6. - Nomenclatura de l a Citometria de Flujo.Pag. 96.
B. - APLICACIÓN DE
LA
CITOMETRIA DE FLUJO EN
EL CÁNCER DE MAMA
Pag. 99.
C - PLOIDIA Y FASE S: Parámetros de u t i l i d a d
clínica
Pag. 103.
1. - P l o i d l a
Pag. 103.
2. - Fase S
Pag. 108.
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
Pag. 110.
OBJETIVOS
Pag. 112.
MATERIAL Y MÉTODO
Pag. 114.
A. - SUJETOS DEL ESTUDIO
Pag. 114.
1. - Definición de l a población a estudiar. .Pag.
2. - Definición
de
l o s individuos
114.
del
trabajo de investigación
Pag. 115.
2a.- Selección de pacientes
Pag. 115.
2b.- Recogida d e l material
Pag. 116.
2c.- C r i t e r i o s de inclusión....
Pag. 117.
2d.- C r i t e r i o s de exclusión
Pag. 117.
2e.- Tamaño de l a muestra
Pag. 118.
2f.- Gmipo control
Pag. 119.
B. - TÉCNICAS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS
C - PLANTEAMIENTO METODOLÓGICO
1. - Obtención de l a muestra
2. - Desparafinización
..Pag. 122.
Pag. 127.
Pag. 127.
Pag. 130.
3. - Homogeneización de l o s cortes d e l
tumor
Pag. 131.
4. - Digestión enzimática mediante pepsina. .Pag.
5. - Centrifugación
132.
Pag. 134.
6. - Tinción d e l DNA y destrucción d e l RNA. .Pag. 134.
7. - Preparación de l a s muestras para su
procesamiento por e l Citómetro
de F l u j o
Pag. 135.
8. - Elaboración d e l c o n t r o l . . .
Pag. 137.
9. - Utilización d e l CitóiMtro de F l u j o
Pag. 141.
D.- VARIABLES A MEDIR
Pag. 144.
E. - INTERPRETACIÓN DE LAS VARIABLES
Pag. 146.
F. - ESTUDIO ESTADÍSTICO
Pag. 152.
RESULTADOS
Pag. 155.
A. - RESULTADOS DE LAS VARIABLES CLINICOPATOLOGICAS
Pag. 156.
B. - RESULTADOS DEL CONTENIDO DE DNA (PLOIDIA) .Pag. 165.
C - RESULTADOS DE LA FASE S
Pag. 168.
D.- RESULTADOS DEL ESTUDIO ESTADÍSTICO
Pag. 171.
1. - Estudio Univariante
Pag. 171.
2. - Tablas de Supervivencia
Pag. 189.
2a.- Gráficas de supervivencia
Pag. 190.
3. - Regresión Logística Múltiple
Pag. 205.
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
Pag. 210.
A. - IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE LOS
FACTORES PRONÓSTICOS
Pag. 212.
B. - ANÁLISIS DE LOS FACTORES PRONÓSTICOS
CLINICO-PATOLOGICOS CLASICOS
Pag. 218.
C - ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE DNA MEDIANTE
LA CITOMETRIA DE FLUJO. ANÁLISIS DE LA
PLOIDIA
Pag. 220.
D.- ANÁLISIS DE LA FASE DE SÍNTESIS CELULAR
NEOPLASICA O ÍNDICE PROLIFERATIVO
Pag. 231.
CONCLUSIONES
Pag. 241.
BIBLIOGRAFÍA
Pag.
245.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.- Incidencia d e l Cáncer de Mama
Pag. 13.
Figura 2.- Evolución de una célula cauícerosa.. .Pag. 32.
Figura 3.- Cromosoma 17
Pag. 77.
Figura 4.- Representación esquemática de un
ciclo celular
Pag. 81.
Figura 5.- Representación d e l c i c l o c e l u l a r
mediante Citometría de F l u j o
Pag. 82.
Figura 6.- Partes detalladas y funcionamiento
de un Citómetro de F l u j o
Pag. 91.
Figura 7.- Histograma d i p l o i d e
Pag. 106.
Figura 8.- Histograma aneuploide
Pag. 107.
Figura 9.- Histograma donde se representa
l a fase S
Figura 10.- Representación de histogramas
Pag. 109.
Pag. 120.
Figura 11.- Representación de histogramas
anómalos
Figura 12.- Citómetro de F l u j o
Pag. 121.
Pag. 123.
Figura 13.- Citómetro de F l u j o . Pantallas
y consola
Pag. 124.
Figura 14.- Citómetro de F l u j o - Cámara donde
e l láser r e a l i z a e l contaje
Pag. 125.
Figura 15.- Citómetro de F l u j o . Detalle de
los fotomultiplicadores
Pag. 126.
Figura 16.- Preparación de Hematoxilina-Eosina
de un cáncer de mama
Figura 17.- Preparación de Hematoxilina-Eosina
Pag. 128.
de un ganglio invadido por células
de un cáncer de mama
Figura 18.- Gráfica relacionando
Pag. 129.
supervivencia
y edad
Figura 19.- Gráfica relacionando
Pag. 190.
supervivencia
y antecedentes familiares de
cáncer de mama
Figura 20.- Gráfica relacionando
Pag. 191.
supervivencia
y antecedentes personales de patología mamaria
Figura 21.- Gráfica relacionando
Pag. 192.
supervivencia
y fase S d e l tumor primario
Figura 22.- Gráfica relacionando
Pag. 193.
supervivencia
y fase S d e l tumor primario r e c o d i flcada (< 12, > 12)
Figura 23.- Gráfica relacionando
Pag, 194.
supervivencia
y tamaño tumoral
Figura 24.- Gráfica relacionando
Pag. 195.
supervivencia
y afectación ganglionar
Pag. 196.
Figura 25.- Gráfica relacionando supervivencia
y metástasis (M)
Pag. 197.
Figura 26.- Gráfica relacionando supervivencia
y Receptores Estrogénicos
Figura 27.-Gráfica relacionando
Pag. 198.
supervivencia
y Receptores Progestágenos
Pag. 199.
Figura 28.- Gráfica relacionando supervivencia
y N histológico
.Pag. 200.
Figura 29.- Gráfica relacionando supervivencia
y ploidía
Pag. 201.
Figura 30.- Gráfica relacionando supervivencia
y menopausia
Pag. 202.
Figura 31.- Gráfica relacionando supeirvivencia
y r e c i d i v a s locorregionales
Pag. 203.
Figura 32.- Gráfica relacionando supervivencia
y metástasis diagnosticadas en e l
seguimiento
Pag. 204.
ÍNDICE PE TABLAS
Tabla 1.- Duración de varios c i c l o s celulares..Pag. 85.
Tabla 2.- Edad de l a s pacientes
Pag. 156.
Tabla 3.- Antecedentes f a m i l i a r e s de cáncer
de mama
Pag. 157.
Tabla 4.- Antecedentes personales de patología
mamaria
Pag. 157.
Tabla 5.- Número de embarazos
Pag. 158.
Tabla 6.- Tamaño tumoral (T)
Pag. 159.
Tabla 7.- Afectación ganglionar (N)
Pag. 159.
Tabla 8.- Metástasis (M)
Pag. 159.
Táhla 9.- Tipo histológico
Pag. 160.
Tabla 10.- Receptores Estrogénicos.-
Pag. 160.
Tabla 11.- Receptores Progestágenos
Pag. 161.
Tabla 12.- Tratamiento radioterápico
Pag. 161.
Tabla 13.- Tratamiento quimioterápico
Pag. 162.
Tabla 14.- Tratamiento hormonoterápico
Pag. 162.
Tabla 15.- Recidivas locorregionales
Pag. 163.
Tabla 16.- Metástasis en e l seguimiento
Pag. 163.
Tabla 17.- Supervivencia
Pag. 163.
Tabla 18.- Pacientes c l a s i f i c a d a s por estadios.Pag. 164.
Tabla 19.- Ploidía d e l tumor primario
Pag. 166.
Tabla 20.- Ploidía de l o s ganglios a x i l a r e s
Pag. 166.
Tabla 21.- Ploidía de l a s metástasis
Pag. 166.
Tabla 22.- Ploidía de l a s r e c i d i v a s l o c o r r e gionales
Pag. 167.
Tabla 23.- Ploidía de l o s ganglios a x i l a r e s
invadidos extirpados con l a s
recidivas locorregionales
Pag. 167.
Tabla 24.- Fase S d e l tumor primario
Pag. 168.
Tabla 25.- Fase S de l o s ganglios a x i l a r e s
Pag. 169.
Tabla 26.- Fase S de l a s metástasis
Pag. 169.
Tabla 27.- Fase S de l a s r e c i d i v a s l o c o r r e gionales
Pag. 169.
Tabla 28.- Fase S de l o s ganglios a x i l a r e s
invadidos extirpados con l a s
recidivas locorregionales
Pag. 170.
INTRODUCCIÓN
Cáncer de mama
INTRODUCCIÓN
A.- INCIDENCIA DEI. CÁNCER DE MAMA
El
cáncer
de mama
enfermedad pandémica.
mujeres de todo
ha llegado
a
convertirse
Es uno de los más
e l mundo.
en una
frecuentes
Además su incidencia
en l a s
sigue en
aumento.^'^
En 1900
e l cáncer de mama
muertes por 100.000
100.000
en 1930.
mujeres,
provocó en EE.UU. unas 13.5
para pasar a ser de 23.2 por
Según l a QMS,
e l número anual de muertes
por cáncer de mama fue estimado en 1975 en 541.200.-^ En l o s
últimos años
del cáncer
se ha podido comprobar un aumento progresivo
de mama en los países occidentales.
En unos 20
años se ha pasado de una i n c i d e n c i a de 1/20 a 1/11.^
En EE.UU.,
1 de cada 14 mujeres, sufre un cáncer de mama
durante su vida^
9.
En Gran
respecto
y más recientemente se habla de
Bretaña
l a incidencia
d e l cáncer
1 de cada
de mama,
a l t o t a l de cánceres es de un 25%, siendo en España
aproximadamente
de un
17%.^
En e l resto de países a l
e x i s t i r grandes d i f e r e n c i a s se ha intentado hacer un resumen
en
un gráfico.
(Fig.
1)
Se ha v i s t o que e l riesgo
de padecer cáncer de mama se
asocia a un e s t i l o de v i d a occidental, a una dieta e s p e c i a l ,
a
v i v i r en zonas urbanas más que en rurales,
además
e l estado
influyendo
hormonal de l a mujer, presentándose más
11
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
cánceres en l a menopausia.
Estudios
el
área
recientes,
geográfica
correlacionando un grupo r a c i a l con
y la
indican que e l patrón
incidencia
cultural
del cáncer
de mama,
en una determinada área
geográfica es más importante que l a raza.
Por ejemplo, l a
enfermedad neoplásica de mama es tres veces más frecuente en
negros de C a l i f o r n i a que en negros de Nigeria
también en mujeres blancas
de Alameda
veces más frecuente e l cáncer de mama
o Sudáfrica,
(California)
es 4
que l a s que viven en
áreas rurales de Polonia.
Puede decirse,
que e l cáncer de mama es e l
frecuente de las mujeres.
cáncer más
Es l a p r i n c i p a l causa
de muerte
entre mujeres de 40 a 44 años.^'^
Un parámetro que pretende medir l a s
causas de mortalidad
prematura, o sea, antes de que l a mujer alcance l a esperanza
de vida
vida
estimada,
perdidos.
evaluar
manera
es l a valoración de
Las ventajas
de ese
parámetro residen en
l a e f i c a c i a de l a medicina preventiva
de l a labor a s i s t e n c i a l .
e
indica
mejor
diagnóstico
adecuado de l a enfermedad o
bien,
y en c i e r t a
E l patrón de mortalidad
prematuro ,debido a l cáncer de mama,
países
años potenciales de
es d i s t i n t o según l o s
precoz
y tratamiento
hábitos o formas de vida
que pueden ser corregidos .
12
M. Sisteré
Cáncer de mama
CÁNCER DE MAMA
Tabla de incidencias en diversos países
20=1
i'"^
'-'r"^'I""''
••nx U.K.
' i ' " ^ '••'T"^
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I
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Iirul ln«U tlnfi» Ohlnt
J*P*R
i"'
v
AuatrtIN. Z*l
1
HM>I
1
r
Oan«4Ue.UU.O*l*
Fig.1
Figura 1.- Diagrama de barras mostrando l a mortalidad
cáncer de mama en diversos países.
13
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
B.- FACTORES DE RIESGO DE PM)ECER UN CÁNCER DE MAMA
Una variedad
como
de factores
son; factores
Interrelaclonados
genéticos,
entre e l l o s
ambientales y endocrinos,
parecen estar asociados con un aumento d e l riesgo de padecer
cáncer de mama.
de
varios,
Pero n i un único factor,
actualmente
explican
n i l a combinación
l a etiología
de
esta
enfermedad maligna.^'^
Algunos de los factores
de riesgo de padecer cáncer de
mama más estudiados son: h i s t o r i a f a m i l i a r de l a enfermedad,
menopausia
después
tardía,
nuliparidad,
de los 35 años,
mamográficos,
elevadas
primer embarazo a término
edad avanzada,
dosis
displasia
mamaria
asociada
carcinoma
invasivo
previo
c i e r t o s patrones
de anticonceptivos
a
proliferación
contralateral
y
orales,
epitelial,
carcinoma i n
situ.8
1.- Definición de f a c t o r de riesgo
E l riesgo debe d i f e r e n c i a r s e de l a causa.
E l riesgo no es un factor s u f i c i e n t e para que tenga lugar
l a enfermedad.
Un
80% de l o s cánceres
no se pueden e x p l i c a r
por l o s
factores de riesgo.
14
M. Sisteré
Cáncer de mama
La
presencia
de
factores
de riesgo
va unida
a una
probabilidad.
Los factores de riesgo se han hecho basados
en estudios
retrospectivos.^
2.- Factores de a l t o riesgo en e l CáncptT- dp» Mama
b]^.- Sexo: La mujer tiene un 99% de probabilidades de
sufrir
cáncer
de mama,
frente a un
1% d e l
hombre.
b2.- Edad: A cualquier
mama.
edad puede aparecer un cáncer de
Por debajo de l o s 30 años es difícil l a
aparición. La frecuencia aumenta
con l a edad
y se e s t a b i l i z a entre los 45-55 años, vuelve a
aumentar
80-85
paulatinamente
años y
tener
para l l e g a r
e l doble
a los
de i n c i d e n c i a
que a los 60-65.'^
b3.- Factores
étnicos
y
raciales:
tienen
mayor riesgo
mama.
En
blancas,
e l mismo
tienen
Las mujeres judías
de s u f r i r
un cáncer de
habitat, las
más probabilidades
mujeres
que
las
de raza negra.
El
cambio de patrones
afecta
más que una determinada localización
geográfica o e l t i p o
las
c u l t u r a l e s , parece que
mujeres
15
de una
de raza afectado. Cuando
etnia
han cambiado su
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
residencia y por
sociales,
consiguiente
el
cáncer
de
las costumbres
mama
ha ido
en aumento. Por ejemplo las japonesas viviendo
en
Japón
tienen
enfermedad
una
de un 13.9
incidencia
de l a
cuando se trasladan a
v i v i r a Hawai es de un 29.6.-^ A l igual que l a s
mujeres
de c o l o r
que viven
en
California,
tienen tres veces más probabilidad que las de
l a misma raza de Nigeria o Sudáfrica.^
b^.- H i s t o r i a f a m i l i a r de cáLncer de mama:
Cáncer f a m i l i a r . -
Trata de una determinada f a m i l i a dónde
hay varios miembros de parentesco cercano que
sufran l a enfermedad.
Representa
e l 13% d e l
t o t a l de cánceres de mama.
Una fuerte relación entre e l cáncer de mama y
una h i s t o r i a
algo
familiar
de l a enfermedad, es
que se conoce desde
romanos,
e l tiempo
de l o s
pero no fue hasta mediados del s i g l o
XIX cuando se escribió algo de e l l o . Un médico
francés,
Paul
Broca,
dijo
que una larga
sucesión de cánceres en una f a m i l i a , no podía
a t r i b u i r s e a l azar.^
Las
familias
número
en l a s que puede
de
cánceres
caracterizadas por
la
enfermedad,
de
verse mayor
mama,
una aparición temprana de
la
media
de
edad d e l
diagnóstico se sitúa en 44.9 años.-'-^
16
son
M. Sisteré
cáncer de mama
Cáncer de etiología h e r e d i t a r i a . tiene
unas
Este
tipo
características
que
de cáncer
l e suelen
diferenciar:
Representa e l 5% del t o t a l de cánceres de
mama.
-
Aparece por debajo de los 40
años en todos
los miembros de l a familia.
E l cáncer suele ser b i l a t e r a l .
-
Va asociado a otras
de
enfermedades ( cáncer
ovario, Enfermedad
de
Cowden's,
alteraciones dermatológicas,...).
Histopatológicamente
se
encuentran
hiperplasias atípicas.
El
tipo
más frecuente
es e l carcinoma
medular.^
Recientemente
grupos
se ha demostrado, en estos
familiares, l a e x i s t e n c i a de un gen
localizado
en e l cromosoma
17 como e l
causante de l a enfermedad maligna
de mama.
3.- Factores de riesgo medio en e l Cáncer de Mama
Ci'-
Hormonales:
La menarquia tardía
menopausia
artificial
(>15 años)
se asocian
y la
a menor
frecuencia de cáncer de mama.
La
menarquia
precoz
y
menopausia
natural
tardía, se asocian a mayor f r e c u e n c i a . '
17
M. Sisteré
Citometría de Flujo
Factores reproductivos:
El
embarazo actuaría como
factor protector.
E l tener e l primer
h i j o por encima de
los 35
años, aumenta e l riesgo tres veces más.
La
nuliparidad se
cambio
asocia a
la esterilidad
mayor riesgo, en
puede
ser
un
factor
protector.
La lactancia es un factor
protector frente a l
cáncer de mama durante e l periodo fértil de l a
mujer,
pero
no
tiene ninguna
significación
durante l a menopausia.
Antecedentes personales de patología mamaria:
Para
diagnosticar
precozmente
incluso para detectar
el
cáncer
e
lesiones precancerosas,
antes de l a aparición del carcinoma " i n s i t u " ,
se
deben
adecuadamente
diagnosticar
y
tratar
aquellas lesiones absolutamente
benignas y l a s que
pueden
tener
tendencia a
malignizarse.
Existen unas formas
especiales de mastopatías
benignas, s i n ninguna
tendencia a malignizar?
estas son:
-
Adenosls
proliferación
esclerosante,
se
de conductillos
trata
de
una
terminales con
f i b r o s l s asociada, que causa distorsión de l o s
lobulillos.
18
M. Sisteré
Cáncer de laama
que
Adenosls mlcroglandular,
hay
una gran
terminales
enfermedad
cantidad
de
en l a
conductillos
dilatados, asemejando glándulas que
p r o l l f e r a n desordenadamente.
-
Cicatriz
radial,
esta
aspecto e s t r e l l a d o
lesión
con
tiene
formación
un
de
estructuras tubulares que Irradian a p a r t i r de
un núcleo c e n t r a l de f i b r o s l s y e l a s t o s l s . Los
túbulos
con un carcinoma
19
tanto mamográf lea como macroscópicamente.
Otras
pueden
confundirse
mastopatías
tienen
más
tendencia
a
malignizar. Entre éstas se h a l l a n :
- Quistes.
- Hlperplasias e p i t e l i a l e s .
- Procesos papilares.
- Ectasias ductales. •'•
En
la
actualidad,
citohistologia
sólo
disponemos
para establecer
de
la
unos c r i t e r i o s
de premalignidad, ninguna otra prueba clínica,
biológica
o
instrumental
nos
puede ser
de
ayuda.
Para poderse hablar
ha
de encontrar
epitelio
de
dos
de
lesión premaligna, se
características
en
el
l a glándula mamaria: H i p e r p l a s i a
E p i t e l i a l y A t i p l a s Celulares.
El
epitelio
normal
por acción
desconocido, puede hacer
19
una
de un f a c t o r
evolución hacia
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
una
hiperplasia
lobulillar,
ductal
siendo
reversible.
esa
Pero caso
factor (factor
hiperplasia
promotor),
aún
puede
en un
originando
carcinoma
evolución
de que actúe un nuevo
adentrarse
malignidad,
o hiperplasia
intraductal
esa
terreno de
respectivamente
"no invasivo"
un
y un
carcinoma " i n s i t u " .
En e l estudio de las enfermedades
la
mama, numerosos
autores
conformidad
o disconformidad
evolución
hacia
enfermedad.
Black
conocer
que
el
benignas de
han dado su
respecto
l a malignidad
de l a
en 1969,-^-^
la
a la
ya d i o a
hiperplasia
atípica,
moderada y severa determinan un riesgo 5 veces
mayor de padecer un cáncer de mama invasor.
Haagensen en 1971, encontró una incidencia
cáncer en l a enfermedad q u i s t i c a
superior
a
l a esperada.
dijo
1912,^^
fibroquística,
los
cambios
que
de l a mama,
Silverberger
en
de
la
en
mastopatia
l a proliferación i n t r a d u c t a l y
papilomatosos
premalignos,
sugieren
que
evolucionan
malignización de l a
enfemedad.
la
De Birux en
asegura
constituye
un estado preneoplásico. Alvarenga
una
1980,•'•^ encontró en e l
incidencia
del 27.6%
la
hacia
1979, •'•^
en
que
cambios
hiperplasia
carcinoma
de h i p e r p l a s i a
invasivo
ductal típica
y de hiperplasia ductal atípica d e l
20
M. Sisteré
Cáncer de mama
15.95%.
ambas
En mamas s i n cáncer l a incidencia de
hlperplasias
fue d e l 16.66%
y del
1.13% respectivamente.
También
existen
acuerdo
con
MacDivitt,
1972,
autores
que
no están de
l a relación
mastopatía/cáncer.
Stewart y Berg
en 1968, Devitt en
y Gros
en 1980,-'-'' quien señala que l a s
proliferaciones
intraductales
epiteliomas " i n s i t u " ,
evolucionar
hacia
denominadas
tienen p o s i b i l i d a d de
un cáncer,
aunque esa
p o s i b i l i d a d sigue siendo mal conocida.
Más
recientemente
MacDivitt
cambiado algo su c r i t e r i o
mujeres
con
afectas
atipla
y
(1992),^^ ha
sugiere
enfermedad benigna
de h i p e r p l a s i a
celular,
y
a
de mama,
con o s i n
l a s padecedoras
fibroadenoma, deben
exhaustivamente
epitelial
que l a s
ser
causa
de un
monitorizadas
d e l elevado
riesgo
de poder malignizarse.
Tratamientos honiK>nales: Aunque no existen datos que
indiquen que e l uso de anovulatorios
marcha l a carcinogénesis,
mujeres con cáncer
fármacos
puede
ponga en
se ha v i s t o
de mama,
que en
l a toma de estos
acelerar
e l crecimiento
tumoral.^
En un estudio realizado en Suecia, l a s mujeres
que habían
orales
empezado a tomar anticonceptivos
desde
21
muy
jóvenes,
solían
M. Sisteré
estar
Citometría de Flujo
afectas de tumores de mama de mayor
tamaño,
menor concentración de receptores estrogénicos
y peor
pronóstico,
comparándolas con l a s que
empezaron más tarde l a
antlconcepclón
oral o
las que no llegaron a tomar. •'•^
Los
estrógenos
en
la
menopausia
suelen
aumentar l a incidencia de cáncer de mama s i l a
toma es superior a l o s 10 años.^
Los estudios
son
con preparados
muy escasos.
de progesterona
Tan sólo existen algunos en
los que se han u t i l i z a d o preparados
depot, y
en general no evidencian una asociación entre
e l cáncer de mama y l a administración de estos
preparados hormonales.
La toma de anticonceptivos orales trifásicos o
secuenciales, sí entabla una estrecha relación
con l a aparición de una enfermedad
maligna de
21
mama.^ ^
Factores dietéticos:
mama
esté
E l hecho de que e l cáncer de
aumentando
anglosajones
en
y en l a s capas
sociedad,
hace
asociada
a
alimentarios
pensar
unas
como
los
países
media-alta de l a
en l a forma de vida
costumbres
o
hábitos
factores determinantes
para algunas mujeres.^
Se ha encontrado relación entre e l
mama y
ingesta
l a obesidad,
diaria
22
cáncer de
dietas r i c a s en grasas e
de carne. •'•''^ No
se observó
M. Sisteré
Cáncer de mama
relación
con l a ingesta d i a r i a
de pescado,
verduras y leche. •'•
Se
ha
especulado
sobre
el
consumo de
determinadas vitaminas (A, E) como prevención
del
cáncer,
por e l poder antioxidante d e l
r e t i n o l y beta-caroteno.^
Exposición a iirradiacioness Las mujeres de Hirosima
y Nagasaki
sufren mayor
incidencia de cáncer
de mama.
También hay un aumento en mujeres que en su
juventud
sufrieron
exámenes
frecuentes o radioterapia
la
mama,
mastitis
sobre
todo
postparto
radioscópicos
antiinflamatoria en
en l a s afectadas
y
tratadas
de
con
radioterapia.^
Factores menos asociados con e l Cáncer de Mama
- Diferencia urbana/rural: E l riesgo de padecer cáncer
de mama es mucho más elevado
que en zonas
diferentes
Alemania
Suiza y
rurales,
en áreas urbanas
siendo corroborado por
estudios realizados
Occidental,
Australia;
en
Francia,
Japón,
Rumania,
s i n embargo no se observó
t a l fenómeno en Inglaterra y Gales.
23
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
Tabacos
Parece
ser que e l hábito
cigarrillos
aumenta
el
de
riesgo
fumar
de padecer
cáncer de mama cuando se estudia en relación
con
el
estatus
realizados
económico, en
en Japón.
mucho más s i
Además
estudios
se incrementa
se asocia a l consumo
d i a r i o de
carne.
Alcohol:
E l consumo de bebidas alcohólicas se sabe
que suele aumentar e l riesgo
cánceres en
faringe,
de s u f r i r varios
humanos. Siendo l a cavidad
laringe,
localizaciones
esófago
e
más frecuentes.
oral,
hígado l a s
No
se puede
confirmar una evidencia de asociación entre e l
consumo de alcohol y e l padecimiento de cáncer
colo-rectal
y
de mama.^^
numerosos estudios
tasa de mortalidad
Hasta
parecían
hace
indicar
para e l cáncer
por 100.000,
11.1 por
frente a
100.000).-'-
publicado
alcohol
las no bebedoras
Recientemente
diversidad
que l a
de mama era
más baja en bebedoras habituales de
(3.9
poco
de
se han
trabajos
que
demuestran todo l o contrario.^-^'
El
alcohol
padecer
suele
cáncer
incrementar
de
e l riesgo de
mama
en
mujeres
postmenopáusicas.
En
una revisión de varios
en
l a Universidad
relación,
cáncer
24
estudios
de Edimburgo,
de mama
y
realizada
sobre l a
consumo de
M. Sisteré
cáncer de mama
alcohol,
se puede afirmar
existe alguna asociación,
en e l
papel
que en l a mayoría
aunque s i n exagerar
d e l alcohol
como
inductor d e l
cáncer de mama, pues hay otros factores mucho
más importantes.^ ^
Retrovirus asociados a carcinogénesis.
Durante
muchos
años
retrovirus
eran
los
formación
de
tumores
posiblemente
en
espectacular
el
se
pensó
responsables
en
años
los
de l a
animales
hombre.
y
Gracias a l
desarrollo de l a s técnicas de
manejo de material genético
los
que
en l a década de
setenta-ochenta,
se comprobó que
los genes de los retrovirus responsables de l a
transformación c e l u l a r , eran en r e a l i d a d genes
celulares
modificados
secuestrarlos
por e l
del genoma de
virus a l
l a célula a l a
que i n f e c t a .
Los oncogenes presentes en los v i r u s no son de
origen vírico,
sino genes normales de l o s que
e l v i r u s se apropia
durante su multiplicación
en l a célula a n f i t r i o n a .
25
M. Sisteré
REVISIÓN DE
CONCEPTOS
Citometría de Flujo
REVISIÓN DE CONCEPTOS
A.-
ONCOGENESIS. BIOLOGÍA TDMORAL
La Oncogénesis es
l a c i e n c i a que
estudia
e l Inicio y
d e s a r r o l l o de l o s cánceres.
Inicialmente
describiremos
los
principales
términos
empleados en oncología:
Hiperplasia; Incremento del número de células.
H i p e r t r o f i a : Incremento
d e l tamaño
de
l a s células
u
órganos.
Metaplasia: Proceso
célula
La
reversible
La
e l cual
diferenciada es s u s t i t u i d a
metaplasia
distribución
a
en
veces
producir
representa un
atípica
paso
hacia
por otra.
originar
una
células, puede
patrones
ocasionalmente
26
a
ordenada de las
metaplasia
encuentra
pese
un t i p o de
desordenados.
resultante,
que
l a d i s p l a s i a , se
en
inflamaciones
M. Sisteré
Cáncer de mama
crónicas.
D i s p l a s i a : Pérdida d e l orden y disposición normal
de l a s
células.
J\naplasia: Ausencia de diferenciación c e l u l a r .
Neoplasia: Proliferación c e l u l a r que excede y que no está
coordinada
con
el
crecimiento
normal
y
persiste a expensas d e l huésped.
1.-
La
Carcinogénesis
carcinogénesis
mediante
puede
inducirse
experimentalmente
l a exposición a agentes exógenos
o
puede o c u r r i r
espontáneamente, s i n intención o intervención activa.
Un
cáncer
radiaciones,
puede
ser inducido
infecciones
se encuentran
en
crónicas y
uno,
o
inevitables
restos
agentes
químicos,
demás carcinógenos que
e l medio ambiente,
interno de cada
como
por
o en e l mismo medio
elaborados o sintetizados casualmente
del
metabolismo
de
ciertas
sustancias habituales.
Muchos
carcinógenos
ocasionan
estructura
d e l DNA^^,
pero
un
e l daño
número
a l alterar l a
s i g n i f i c a t i v o , no
parecen actuar de esa manera.
Los radicales oxigenados
propio metabolismo de
estudios
se
ha
l a s células vivas,
podido
formación d e l cáncer.
son productos
observar
pero en recientes
influencia
en l a
Su manera de actuación sería mediante
l a inducción de daño a n i v e l d e l DNA
directa o indirecta.
su
inevitables d e l
mediante una oxidación
También se ha v i s t o que son capaces de
27
M. Sisteré
Citometría de Flujo
afectar a l a s proteínas de membrana, factores de crecimiento
y sus receptores,
teniendo
capacidad
para
activar
a los
oncogenes. •^^
Un gran progreso se ha realizado en l a identificación
de
genes o desarreglos cromosómicos que tengan relevancia en e l
desarrollo
d e l cáncer,
pero
aún no
es
s u f i c i e n t e para
establecer l a s verdaderas alteraciones genéticas.
La
Agencia
Cáncer,
Internacional
ha
realizado
para
un
estudio
farmacológicos más importantes para
comprobándose que l a mama no
de
fármacos,
pero
esteroideos y no
de
sí
l a Investigación d e l
de
desarrollar
se ve afectada
por algunos
esteroideos,
los agentes
un cáncer,
por l a mayoría
como
l o s estrógenos
progestágenos, combinaciones
estrógenos-progestágenos, d i e t i l e s t i l b e s t r o l , hexoestrol
y l a terapi'a de reemplazamiento estrogénlca.^-^
E l hígado parece ser que desempeña un importante papel en
el
mecanismo
de
controvertido
tema
policíclicos.
se
forman
ciertas
l a carcinogénesis
de
los
química,
debido a l
hidrocarburos
aromáticos
Aún no está c l a r o s i éstos productos químicos
en
e l hígado como producto
sustancias
o
es
del metabolismo de
e l hígado
el
encargado
de
desprenderse de e l l o s .
Las
células
permanecer en
mantienen su
acumulación,
cancerígenas
están
caracterizadas
por
un estado incompleto de maduración, mientras
capacidad de
proliferar.
funcionalmente
E l resultado es una
incompleta
de
poblaciones
c e l u l a r e s , que a l crecer originan un cáncer.
Las lesiones moleculares que ocasionan
l a alteración de
l a maduración, tienen lugar en l a célula madre o en estadios
28
M. Sisteré
Cálncer de mama
intermedios de l a maduración.
Experimentalmente se ha podido demostrar tanto " i n v i t r o "
como " i n vivo",
como las células se transforman en malignas
s i se l a s somete
a unas
acción
de cancerígenos,
estas
células,
correspondientes
retinoico,
presentes
condiciones especiales
interrumpiendo
s i de nuevo
factores
diversos esteres, o
en e l propio
su maduración. A
se l a s
específicos
o bajo l a
activa
con
anti-tumor,
los
ácido
mediante factores naturales
suero,
vuelve a restablecerse l a
maduración cesando e l crecimiento.^-^
E l que l a maduración
lleve
a l cese
d e l crecimiento,
s i g n i f i c a que l a inducción de l a diferenciación constituye
una prometedora aproximación a l tratamiento d e l cáncer.
l a . - I n i c i o y desarrollo de un Cáncer en l a Mama
La supervivencia global
de
las personas
padecedoras de
un cáncer de mama, no se ha podido mejorar en los últimos 20
años.^^
Para saber l a expectativa de vida
tras
diagnosticarle
un cáncer
que tiene
de mama,
una mujer
dejándola s i n
tratamiento, tenemos que remontarnos a f i n a l e s d e l s i g l o XIX
o primeros d e l XX, y resulta que l a media es de algo más de
tres años.
Con una supervivencia d e l 40% a los tres años y
del 18-20% a los 5 años.^'^
En
vivo,
l a actualidad,
no hay manera alguna de detectar en
e l preciso momento
en que unas
parénquima mamario se vuelven
29
pocas
células d e l
cancerígenas,-^^ aunque podría
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
f i j a r s e en
e l periodo comprendido
entre
empezar a
crecer l a mama) y e l primer
mama está
plenamente madura).
l a pubertad ( a l
embarazo (cuando l a
Debido a l rápido crecimiento
de l a s mamas,
algunas células degenerarían. La neoformación
permanecería
silente
clínicamente
más tarde
durante
muchos
ya sea como
años,
apareciendo
una tumoración que
l o c a l i z a l a paciente o e l médico en un control
rutinario, o
por aparecer por pezón unas secreciones anormales.
E l cáncer
más
de mama se encuentra entre l a s
lenta capacidad p r o l i f e r a t i v a .
neoplasias de
Su cinética c e l u l a r no
está en general relacionada con l a extensión loco-regional.
Las tasas de proliferación c e l u l a r son ya imprescindibles
para e l estadiaje de l a enfermedad
y para
establecer l a
necesidad de primeras o segundas líneas de tratamiento.
E l crecimiento c e l u l a r
esta regulado
normal
por hormonas
así como
y por factores
e l neoplásico,
locales
de l o s
t e j i d o s , como factores polipeptídicos de crecimiento.^^
Los tumores crecen, no porque l a velocidad de crecimiento
sea superior a l a d e l t e j i d o
normal,
s i no porque l a media
de producción de células excede a l a media de muerte.
E l tumor
más pequeño
que se puede
detectar mediante
exploraciones físicas o radiológicas es de un centímetro de
diámetro, y ya contiene 10^-10^ células
tumorales.
Un tumor a l crecer se acompaña de numerosos vasos
van
extendiendo para
celular.
Estos
poder mantener
viva
a toda
que se
l a masa
vasos neoformados son a menudo defectuosos,
pudiendo ser fácilmente invadidos por células neoplásicas.
Los
tumores
linfática,
también
que suele
presentan
rodearlos.
30
una importante r e d
Las células neoplásicas
M. Sisteré
Cáncer de mama
también
invaden esos
vasos,
alojándose
regionales, exactamente en los senos
La fase
corta
clínica
de
de un cáncer
l a historia
realiza e l
diagnóstico,
subcapsulares.
de mama,
es l a fase más
natural de su evolución,
cuando se
ya se han sucedido innumerables
d i v i s i o n e s celulares que han originado
enfermedad,
en los linfáticos
han aparecido
l a extensión
l a s metástasis.
actualidad, aún indetectables
Siendo
de l a
en l a
clínicamente. (Fig. 2)
La diseminación hemática y linfática ocurren en paralelo.
Se piensa que e l
30% de las pacientes
a l a s que se l e s
diagnostica un tumor tienen ya clínicamente metástasis. Del
70%
restante,
l a mitad se curarán con tan sólo
tratamiento
l o c a l y e l otro 50% tendrán metástasis ocultas.
Lo
anterior
pacientes
sufrirán
nos l l e v a
a
pensar
a l a s que se dlagnostlq[ue
diseminación metastáslca
que un 65% de l a s
un cáncer de mama ya
por tan sólo
un 35% que
permanecerán indemnes con nada más que un lesión l o c a l i z a d a .
Estos estudios han hecho v a r i a r
cáncer
de
mama
convirtiéndolo nada
como
una
e l concepto clásico d e l
enfermedad
más diagnosticarse
localizada,
en una enfermedad
generalizada.
31
M. Sisteré
C i t o n e t r l a de Flujo
CÁNCER DE MAMA
Historia
natural
del
cáncer
¥l8ibte
Iw i si ble
iftos 1
§
6
8
9
10
11
12
Fase Clínica
Fase Preclínica
Diagnéstico precoz
Fliyra 2.
Tiempo de duplicación aproximado: 100 días
Figura 2.- Representacién esquemática de
l a evolución de
una célula neoplásica.
32
M. Sisteré
cáncer de mama
2.-
Biología Tumoral
2a.- Generalidades
En
1956 C o l l l n s
celular
observando
en e l cáncer
e l tiempo
de mama, ya sea
de duplicación
clínicamente por
mediciones radiológicas o en c u l t i v o s de t e j i d o s , estableció
que
una célula
28-164
tumoral que media
10 milimicras
días l l e g a r a un volumen tumoral de
puede en
1 mg. o 1 mm,
necesitándose para e l l o 20 duplicaciones, siendo l a forma de
crecimiento
exponencial.
Para
alcanzar
1
necesarias 30 duplicaciones. Ya entonces,
duplicaciones
más,
se
alcanzaría
correspondiente en teoría
un
gr. serán
con tan sólo 10
volumen
tumoral
a l Kg., totalmente incompatible
con l a vida.^^
En
l a figura 2, se puede observar l a evolución
hipotética célula cancerosa
de una
desde su aparición hasta que se
l l e g a a formar e l tumor clínicamente
detectable
y luego e l
continuo aumento de tamaño s i se deja s i n tratamiento.
E l tiempo de doblaje tumoral en l a mama se calcula en 100
días .
De este estudio se han de tener presentes dos cosas muy
importantes:
1^.- Un tumor que tenga un tiempo de doblaje de
(el
correspondiente
durante muchos
a l cáncer
años antes
de
100 días
mama),
crece
de que e l paciente
médico se den cuenta de él.
33
M. Sisteré
oel
Citometria de Flujo
23.- Cuando
el
tumoral
tumor
se
solamente
multiplicaciones
hace
palpable,
debe
l a población
realizar
para doblar e l
tres
diámetro tumoral y
tan sólo 10 multiplicaciones celulares para alcanzar
e l tamaño de 1000 gr.
Existen dudas respecto
a l a teoría anterior.
cancerígenas que forman un
el
21
y e l 65%
tumor de
de l a masa
Las células
mama constituyen
tumoral,
entre
e l resto l o ocupa e l
estroma, colaborando a l aumento de volumen.
2b.- Cascada Metastásica
Una
célula
primario,
tumoral metastásica debe
entrar
torrente sanguíneo,
en e l
en
la
circulación,
abandonar e l tumor
sobrevivir
l l e g a r a un vaso distante,
i n t e r s t i c i o d e l órgano
o parénquima
en
el
extravasarse
y multiplicarse
para i n i c i a r una colonia metastásica.
La interrupción
de l a cascada metastásica
en cualquiera
de los pasos, puede prevenir l a producción de metástasis.
Parada
y
Extravasación
de
las
Células
Tumorales
Circulantes t
E l 80% de células tumorales circulantes son células solas
y atacan directamente a l a
superficie
endotelial intacta o
en regiones donde existe una exposición de l a membrana basal
subendotelial.
34
M. Sisteré
cáncer de mama
En
menor
número
de
ocasiones,
circulan
agregadas a leucocitos,
huésped
pudiendo
embolizar
l a s células tumorales
fibrina
o
directamente
plaquetas d e l
en
l o s vasos
precapilares.
Las
células tumorales
en
e l torrente
sanguíneo pueden
permanecer unas 2-3 semanas.
Una célula tumoral adherida a l a s u p e r f i c i e e n d o t e l i a l de
una vénula, rápidamente (1-4 horas) produce l a retracción de
l a célula e n d o t e l i a l , es e l ataque i n i c i a l .
La disolución l o c a l de l a membrana basal,
asociación
con una especie de
pseudópodo
tiene lugar en
por parte
célula neoplásica para cruzar l a membrana basal
elástica,
de l a
y l a lámina
extravasándose, a continuación, en seguida vuelve
a restablecerse e l f l u j o sanguíneo, reparándose e l vaso.
Las
un
células extravasadas
nuevo soporte vascular
proliferan
como colonias, pero
es necesario para crecer
más de
0.5 mm. Como podemos ver, l a angiogénesis es necesaria tanto
a l p r i n c i p i o como a l f i n a l de l a cascada metastáslca.
Teoría de l a Invasión en tres pasos;
Para desmenuzar
neoplásica invade
e l mecanismo
por e l cual
l o s t e j i d o s vecinos se
han
una célula
dividido los
pasos en t r e s etapas;
1^.- Ataque a l a matriz:
Este
paso
es
mediado
por
unas
glicoproteínas
específicas como son; lamínina y f i b r o n e c t i n a .
La laminina
los
tiene una forma de cruz. Suele unirse a
receptores
específicos existentes
35
en diversos
M. Sisteré
Citometria de Flujo
cánceres,
un
especialmente e l de mama. Se ha v i s t o que
elevado
número
de
estos
receptores
desocupado en los tumores mamarios,
está
s i se consigue
ocuparlos con unos ligandos similares
a l a laminina
se podrían prevenir las metástasis.
Secreción de unas enzimas hidrolíticas por parte d e l
huésped
o por
l a s células
tumorales,
que pueden
degradar l a matriz localmente:
Uroquinasa.
Colagenasas tipo I, IV y V.
Proteoglicanos.
Catepsina B.
Heparinasas.
Los
niveles de
respecto
de
estas enzimas
las metástasis
e x i s t i r en un determinado
podrían
informar a l
ocultas
que
puedan
paciente, identificando a
pacientes con elevado riesgo de r e c i d i v a .
Movimiento de l a célula
tumoral en l a región
de l a
matriz modificada por l a p r o t e o l i s i s :
El
por
movimiento
medio
Derivados
de
de
del
componentes
factores
las células
unos
mecanismos
complemento,
del
cancerosas
tejido
quimiotácticos
del
de
quimiotaxis.
colágeno,
conectivo,
para
ocurre
o
actúan
las
como
células
malignas. •^^
36
de
M. Sisteré
cáncer de mama
B.-
CLASIFICACIÓN
CLÍNICA DEL CÁNCER DE MAMA
E l estadiaje del cáncer
siglo
XX,
de mama
con e l concepto
de
empezó
a primeros del
enfermedad
localizada,
diseminación a ganglios regionales y metástasis a distancia.
Un gran
grupos
esfuerzo
de
clasificaciones
se realizó para
similar
pronóstico.
denominadas,
reunir
pacientes en
Apareciendo
Columbia,
cuatro
Manchester,
Internacional y l a Americana Tumor-Node-Metástasis (TNM).'^^
De todos estos c r i t e r i o s ,
e l más extendido
y aceptado
Ínternacionalmente es e l TNM.
Este sistema de clasificación ha sido adoptado
tanto por
l a UICC (International Union Against Cáncer) como por l a AJC
(American Joint Commission i n Cáncer Staging and End Results
Reporting) .
La clasificación TNM
se r e f i e r e
a l tumor
(T), a los
ganglios (N) y a las metástasis (M), y es l a siguiente:
37
M. Sisteré
Citometria de Flujo
1.- TNM
E l cáncer de mama es un proceso evolutivo a
l o largo del
tiempo.
El
conocimiento
enfermedad
de l a p r e v i s i b l e
y del momento
diagnosticada,
evolución
en que se encuentra
va a ser de gran
decisión de los tratamientos
utilidad,
como
de l a
cuando es
tanto
para ver s i éstos
para l a
van a
i n f l u e n c i a r en l a evolución.
Según un esquema
1956,
basado
matemático
observado
en l a s duplicaciones
partiendo de una célula
tumoral,
celulares
diagnosticaría.
tratan,
celular.
Podemos
tumorales,
se llegaría a alcanzar un
tamaño tumoral de medio centímetro a los 8
l a diferenciación
por C o l l i n s en
años de i n i c i a d a
Momento en que clínicamente se
afirmar
que l o s tumores
l o hacemos en los dos últimos años
que se
de su evolución
espontánea. -^^
En l a mama,
l a alteración de l a célula normal, pasando a
célula intermediaria y ésta
a
célula
transformada, podría
haberse i n i c i a d o incluso 20 años antes de l a aparición d e l
cáncer invasivo,
en l a pubertad, cuando l a célula e p i t e l i a l
mamaria presenta e l desarrollo más intenso.
Como base estas teorías, podemos suponer que e l cáncer de
mama tiene una prolongada
producen
vida
múltiples alteraciones
oculta,
y en su i n i c i o se
celulares que tan sólo en
escasas ocasiones desarrollarán un carcinoma.
Una vez iniciado e l cáncer en l a mama,
crecimiento
local,
a
través
conductos
galactóforos,
38
sigue una fase de
de l o s t e j i d o s
manifestándose
vecinos
la
y
primera
M. Sisteré
Cáncer de mama
característica clínica
T. Con l a invasión
de los vasos
linfáticos se alcanzan l a s estaciones ganglionares axilares,
apareciendo e l concepto N.
Más tarde e l paso de l a s células cancerosas de los vasos
linfáticos a l torrente sanguíneo o por invasión directamente
de los c a p i l a r e s ,
tiene lugar
una diseminación
lugar donde se inició e l tumor,
lejos d e l
apareciendo l a s metástasis;
concepto M.
l a . - T; Referido a l tamaño que tiene un tumor
Dos tumores d e l mismo tamaño pueden d i f e r i r
entre sí por
varios motivos.
En
l a misma
masa
tumoral
hay varios
compartimentos
celulares, un compartimento con células neoplásicas activas,
otro
con células
en reposo,
otro
con células
que han
perdido l a malignidad, otro con células necrosadas, e t c . En
el
estudio histológico se observa que tampoco
misma
proporción
de células y tejido
existe una
conectivo entre l o s
diferentes tumores de mama.
Otra
su
característica a tener
velocidad de crecimiento.
alcance
cortas
un determinado volumen
en cuenta en cada tumor es
Es muy d i s t i n t o
en un tiempo
duplicaciones a que e l tiempo
que un tumor
muy corto con
sea más grande con
largas duplicaciones.
Esta velocidad de crecimiento puede detectarse en algunos
casos por l a clínica. E l Instituto Gustav Roussy, estableció
l a clasificación
inflamatorio.
P.E.V..
E l P.V.E.-3
sería
e l carcinoma
En e l P.E.V.-2, los signos inflamatorios sólo
afectarían una porción de l a glándula.
39
En e l P.V.E.—1 no
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
habría
signos
rápido,
inflamatorios que
solamente
volumen en poco
Otro
un crecimiento
se valoraría clínicamente un
aumento de
tiempo.
medio
proporción de
indicaran
incruento
que
crecimiento
Algunos más actuales
nos
ayudaría
tumoral,
sería
son l a captación
a
saber
la
l a termografía.
de timidina t r i t i a d a
por e l tumor o l a ploidía.
Ib.- N:
Concepto
secundaria
referido
al
a
l a afectación ganglionar
diagnóstico
de
un
tumor
en
la
glándula
La
presencia
neoplásicas,
de
ganglios
invadidos
por
indica e l paso de células siempre.
células
Caso de no
estar afectos los ganglios, no es indicador de no invasión o
diseminación,
pues
e l escape c e l u l a r ha podido r e a l i z a r s e
por un by-pass anterior a l ganglio o puede
un
paso d i r e c t o
a sangre.
que
haya habido
Pudiendo e x i s t i r metástasis con
ganglios negativos.
La evaluación
ser
de
clínica de l a afectación
un 30-40%
de error,
ganglionar suele
tanto para ganglios p o s i t i v o s
como negativos.
Cuando se encuentran de uno a tres
nivel
axilar,
afectación
de
algunos
la
autores
cadena
ganglios
aconsejan
mamaria
invadidos a
l a búsqueda de
interna, considerándose
esta valoración de gran v a l o r pronóstico.'^^
l e - M;
Concepto
referido
a l hallazgo de
maRa tnrrioral
l e j o s d e l lugar donde se detectó por priinera vez
40
M. Sisteré
Cáncer de mama
La idea de M ( negativa ), s i g n i f i c a que con los métodos
actuales a nuestro alcance,
no
somos capaces
de encontrar
ninguna metástasis.
Sin duda e l concepto de metástasis es mucho más complejo.
Con
anticuerpos
tumorales,
lugares
monoclonales
se ha demostrado
diferentes
células
l a presencia
epiteliales
de éstas en
a l a localización tumoral
intervención de l a masa
clínica,
contra
principal,
que tras l a
no han llegado a dar
evolucionando favorablemente
e l paciente s i n
tratamiento coadyuvante.
Del mismo modo e l THM por s i mismo
independiente de otros factores
tumores de pequeño tamaño
s i no e x i s t e
r e f l e j a un pronóstico
conocidos, es posible que
no reciban tratamiento sistémico
p o s i t i v i d a d ganglionar gracias
a l a excelente
supervivencia .^•^
Algunos estudios denuncian l a tendencia a sobreinvestigar
pacientes asintomáticas, con analíticas y seguimientos óseos
en busca
de metástasis,
exploración física,
s i n tener en cuenta que una buena
un buen
estadiaje
TNM
y mamografías
periódicas son e l método más útil de hacer un seguimiento a
mujeres intervenidas de cáncer de mama.'^'^
Cuando apoyándonos en e l TNM se encuentran
a l t o riesgo,
sí es necesario r e a l i z a r gammagrafías
mujeres que r e f i e r a n
de
metástasis
individuos de
dolores en huesos,
es elevada.
Pero
óseas a
pues l a e x i s t e n c i a
s i l a mujer
no es
e n c a s i l l a d a en ese grupo de riesgo elevado, con l a clínica y
exploración física e l seguimiento es suficiente.'^^
41
M. Sisteré
Citometria de Flujo
CÁNCER DE MAMA;
TQ
TNM
NO
EVIDENCIA
T¿s
DE
TUMOR
SITU
ll
cm.
< 2
> 0.5 a 1 era.
•ib
> 1
a 2 cm.
T2
> 2
a 5 cm.
T3
> 5
cm.
T4
PIEL
/
PARED
T4^
PARED
T4i3
EDEMA
T4c
AMBOS:
T4¿
CARCINOMA
DERMICO/ULCERACION
4 ^ Y A^^
INFLAMATORIO
NQ
NO
N]^
AXILARES
MÓVILES
N2
AXILARES
FIJOS
N3
MAMARIA
Mjj
NO
AFECTACIÓN
GANGLIONAR
INTERNA
SE PUEDE
MQ
NO
M]^
METÁSTASIS
CONFIRMAR
METÁSTASIS
A
A
METÁSTASIS
DISTANCIA
DISTANCIA
TNM Clasificación de Tumores Malignos. UICC. 1987
42
M. Sisteré
cáncer de mama
2.-
Los diversos
Estadios d e l Cáncer de Mama
tipos de TNM para
tener una significación
clínica, y que nos puedan orientar respecto a l a malignidad
o agresividad de un tumor, se han organizado en una serie de
Estadios.
Cada Estadio tendrá
a l anterior,
empeorando
un diferente comportamiento
e l pronóstico
d e l cáncer cuanto
mayor sea e l estadio del que se t r a t e .
Cada tumor
según
se l o c a l i c e
recibirá
un tratamiento
individualizado y estandarizado.
43
M. Sisteré
Citometría de Flujo
CÁNCER DE MAMA: ESTADIAJE
T
N
M
0
Tls
No
MQ
I
Ti
NQ
MQ
TQ
Ni
MQ
Ti
Ni
MQ
T2
NQ
MQ
T2
Ni
MQ
T3
No
MQ
TO
N2
MQ
Ti
N2
T2
N2
MQ
T3
Ni, N2
MQ
T4
cualquier N
MQ
ESTADIO
II
II
III
III
IV
A
B
A
B
cualquier T
N3
MQ
cualquier T
cualquier N
MI
44
M. Sisteré
Cáncer de mama
3.-
Concepto
dinámico
de
l a biología tumoral.
Hipótesis B i o l o g i s t a
En
contrapartida
morfológica"
a
la
teoría
del
TNM,
"teoría
de Halsted, en 1985 Flsher elaboró una "teoría
biológica".
Ambas teorías se definen en 10 puntos específicos.
Hipótesis mecaniclsta
Hipótesis b i o l o g i s t a
1. No
1. Crecimiento tumoral
hay patrón
de
crecimiento
ordenado.
2. Embolización linfática.
2. Extensión linfática
d i r e c t a (en bloque)
3. Ganglios positivos
3. Ganglios positivos
indicador e instigador
huésped-tumor defectuosa
del crecimiento.
4. Ganglios
indican una relación
negativos
4. Los
ganglios
no
son barreras a l paso
barreras a l paso de
de l a s células.
las células.
5. Los ganglios tienen
son
5. Los ganglios tienen
importancia anatómica.
importancia biológica.
5. La diseminación hemática
5. La diseminación hemática
45
M. Sisteré
Citometria de Flujo
es muy
es poco importante.
7. E l tumor evoluciona de
importante.
7. Existe una compleja
forma relativamente
interrelación
autónoma de su huésped.
huésped-tumor.
8. E l cáncer operable es una
8. E l cáncer operable es ya
enfermedad locorregional.
una enfermedad sistémica
9. Las características de
9. E l tratamiento
de l a operación son
locorregional afecta
d e f i n i t i v a s para l a
poco l a supervivencia.
curación.
10. No se considera l a
10. La multicentricidad no
multicentricidad.
es
precursora del
cáncer clínico.
En
la
teoría
morfológica e l crecimiento
anatómico-mecanicista,
y el
punto de
d e l cáncer es
v i s t a terapéutico se
basa en l a r a d i c a l i d a d .
En l a teoría
huésped-tumor,
biológica,
donde se considera una relación
e l tratamiento l o c a l importa poco, surgiendo
e l concepto de tratamiento conservador dentro
un
del marco de
tratamiento general sistémico.'^^
Se ha
insistido
mucho
en
que
el
tumor
primitivo va
aumentando de tamaño hasta l l e g a r a los 2 cm., que es cuando
da l a primera metástasis ganglionar,
46
más tarde a l seguir e l
M. Sisteré
cáncer de mama
crecimiento,
se
produce
ganglionar,para
metástasis
a
una segunda
después
distancia,
metástasis
a nivel
tener
lugar
l a primera
de
afectarse
e l tercer
antes
ganglio.-^^
La idea
anterior
comportamiento
representa
tumoral.
tumores pequeños
l a teoría mecaniclsta d e l
Basándonos
s i n adenopatías
curar siempre con una terapéutica
presentaran
un tamaño
práctica no sucede.
en
esta
teoría, l o s
n i metástasis, deberían
locorreglonal
considerable,
y
l o s que
nunca l o harían. En l a
Hay alrededor de un 20% de discordancia
entre e l comportamiento r e a l y e l esperado según e l TNM.
Paralelamente
correlación
la
a
l a evolución
histopatológica,
h i p e r p l a s i a atípica,
mecaniclsta
existe
una
desde l a h i p e r p l a s i a simple a
a l carcinoma i n s i t u
y luego a l
carcinoma invasivo.
La h i p e r p l a s i a atípica es
de
l a s veces,
un hallazgo casual
acompañando
a
actuales de diagnóstico aún no
mastopatías.
permiten
l a mayoría
Los
métodos
una identificación
s a t i s f a c t o r i a de este grado histológico.
E l carcinoma i n s i t u ,
frecuencia
por
se diagnostica cada vez con mayor
l a biopsia
de
microcalclficaciones
o de
imágenes radiológicas distorsionantes.
E l diagnóstico d e l carcinoma microinvasivo, se f a c i l i t a a
medida que aumenta e l tamaño e invade estructuras vecinas.
El
momento en
maligna es
que una lesión
difícil de
definir,
mamarla
se
se acepta que
convierte en
tiene lugar
cuando se produce l a rotura de l a membrana basal y crece por
fuera de l a s estructuras normales.
47
M. Sisteré
Cáncer de mama
crecimiento,
se
produce
ganglionar,para
metástasis
a
una segunda
después
distancia,
metástasis
tener
lugar
de
afectarse
antes
a nivel
l a primera
e l tercer
ganglio.^^
La idea
anterior
comportamiento
representa
tumoral.
tumores pequeños
l a teoría mecanicista d e l
Basándonos
s i n adenopatías
un tamaño
práctica no sucede.
esta
teoría, l o s
n i metástasis, deberían
curar siempre con una terapéutica
presentaran
en
locorregional
considerable,
y
l o s que
nunca l o harían. En l a
Hay alrededor de un 20% de discordancia
entre e l comportamiento r e a l y e l esperado según e l TNM.
Paralelamente
correlación
la
a
l a evolución
histopatológica,
h i p e r p l a s i a atípica,
mecanicista
existe
una
desde l a h i p e r p l a s i a simple a
a l carcinoma i n s i t u
y luego a l
carcinoma invasivo.
La h i p e r p l a s i a atípica es
de
l a s veces,
un hallazgo casual
acompañando
a
actuales de diagnóstico aún no
mastopatías.
permiten
l a mayoría
Los
métodos
una identificación
s a t i s f a c t o r i a de este grado histológico.
E l carcinoma i n s i t u ,
frecuencia" por
se diagnostica cada vez
l a biopsia
de
con mayor
microcalcificaciones
o de
imágenes radiológicas distorsionantes.
E l diagnóstico d e l carcinoma microinvasivo, se f a c i l i t a a
medida que aumenta e l tamaño e invade estructuras vecinas.
El
momento en
maligna es
que una lesión
difícil de
definir,
mamaria
se
se acepta que
convierte en
tiene lugar
cuando se produce l a rotura de l a membrana basal y crece por
fuera de l a s estructuras normales.
47
M. Sisteré
Cáncer de mama
C - OTROS FACTORES PRONÓSTICOS DEL CÁNCER DE MAMA
1--
Receptores Hormonales
Las proteínas cltoplasmátlcas actúan
unen
y
transfieren
l a apropiada
como receptores que
molécula
esteroldea a l
núcleo para ejercer l a acción hormonal específlea.
Existen
estrógenos
En
dos tipos
hormonales,
l o s de
(R.E.) y los de progestágenos (R.P.).
l a década
determinación
mama,
de receptores
de l o s 70
de receptores
con l a f i n a l i d a d
se empezó
a
utilizar l a
hormonales en l o s tumores de
de poder
dar como
tratamiento
coadyuvante preparados antiestrogénicos o antiprogestágenos.
La
capacidad de unión
estrogénicos,
de l a s hormonas a
de
^H-estradiol
unidos por miligramo de proteína
del cltosol.
Los valores
superiores
se consideran p o s i t i v o s ,
a
se expresa
en
fentomoles
los receptores
10 fentomoles/mg.
mientras que los menores de 3 fentornóles/mg. son negativos.
Alrededor de un 50%
de todos l o s tumores
primitivos son
R.E. p o s i t i v o s , en l a s metástasis l a p o s i t i v i d a d es menor.
Los cánceres
R.E. p o s i t i v o s suelen
tener
3 veces más
metástasis óseas que los R.E. negativos.
49
M. Sisteré
Citometria de Flujo
La cuantía de p o s i t i v i d a d es proporcional
a l grado de
diferenciación y a l subtipo histológico.^•'•''^^
Así
mismo,
se ha v i s t o que ambos
receptores hormonales
son inversamente proporcionales a l a actividad p r o l i f e r a t i v a
del
tumor.Los
tumores R.E.
actividad p r o l i f e r a t i v a más
negativos suelen
alta,
tener una
con una incidencia más
elevada de incorporación de timidina t r i t i a d a . ^-'•'^•'•
Esta elevada actividad mitótica
negativos,
asociada
a tumores R.E.
se r e f l e j a en e l hecho de que los cánceres R.E.
negativos suelen r e c i d i v a r antes que l o s R.E. positivos.
Las pacientes premenopáusicas tienen menor
tumores
R.E.
positivos
(30%),
en
incidencia de
relación
con
las
postmenopáusicas (60%).'^-'La administración previa de quimioterapia
citotóxica, no
i n f l u y e en e l contenido de los receptores estrogénicos.
La
R.E.
respuesta a l tratamiento hormonal
positivos es d e l 50-60%,
mientras
por parte
de los
que en l o s R.E.
negativos es de sólo un 10%.^•'•'^^'^^
Se encuentran receptores
para l a progesterona
en un 40%
de los tumores R.E. p o s i t i v o s .
La distribución d e l R.P.
en las células de tumor de mama
es muy heterogénea.'
Ambos receptores hormonales se hallan presentes en un 46%
de los casos, presentando estos tumores mejor respuesta a l a
hormonoterapia, llegando a ser d e l 77%.
La cuantificación de l o s R.E.
es un buen
predictor para
l a respuesta de cánceres de mama avanzados a l tamoxifeno.
Se han realizado
entre
estudios
l o s receptores
para
hormonales
50
determinar
y
el
l a relación
ciclo
celular.
M. Sisteré
Cáncer de mama
observándose como los R.P.
l a fase
GO-Gl
se sintetizan preferentemente en
del c i c l o celular,
mostrándose unos niveles
constantes durante l a transición de l a Gl a l a G 2 , indicando
que l a expresión de los R.P.
tiempo
es ciclo-dependiente. A l mismo
se explica e l porqué
de l a heterogeneidad de l a
expresión de los R.P..^^
La
determinación
realizarse
de
receptores
habitualmente de forma
o
suele
bioquímica, pero existen
formas más precisas de determinarlos,
anticuerpos
hormonales,
con l a utilización de
de una peroxidasa-antiperoxidasa, mediante
técnicas de inmunocitoquímica.Otra técnica que también es
más sensible
que l a bioquímica es l a Citometría de F l u j o ,
u t i l i z a d a para l a evaluación de los R.P..
Se
ha
pretendido
hormono-receptor,
tiene
del cáncer de mama,
investigar
si
el
estado
alguna relación con e l pronóstico
y según algunos autores, l a p o s i t i v i d a d
del receptor progestágeno es un buen indicador del potencial
de
recurrencia,
independientemente
de l a p o s i t i v i d a d
estrogénica y d e l tratamiento coadyuvante.^^
Otros estudios destacan l a determinación d e l R.E. como de
gran valor pronóstico para e l cáncer de mama, su p o s i t i v i d a d
indicaría
una
negatividad,
postmenopáusico,
gran
supervivencia,^^
combinada
con
mientras
pacientes
en
que su
estado
s i n ganglios afectados pero de raza negra,
parece que tienen un p a r t i c u l a r mal pronóstico.
Se
ha demostrado
una asociación
entre
aneuploidia y
niveles bajos de receptores estrogénicos. Esta asociación se
ha podido
v e r i f i c a r mejor
que con bioquímicos,
con métodos inmunohistoquímicos
l o que sugiere que l a determinación de
51
M. Sisteré
Citometria de Flujo
R.E.
mediante
inmunohistoquimica
monoclonales,
refleja
mejor
empleando
e l estado
diferenciación de las células tumorales .
2.-
biológico
y
de
' '
Ma-rnadores Tumorales
Las diferencias entre l a célula normal y
que
anticuerpos
pueden
ser
especialmente
maligna,
en
utilizadas
etapas
constituye
para
precoces
uno de
el
de
l o s fines
l a neoplásica,
diagnóstico,
l a degeneración
primordiales
de l a
investigación oncológica.
Las
diferencias
celulares,
morfológicas
entre
ambas
extirpes
son empleadas para establecer e l diagnóstico de
cáncer.
Mediante
biología
técnicas
de
bioquímica,
inmunológicas
se
ha
comprobar
molecular,
diferencias
morfológicas
cancerosas,
van acompañadas por cambios
función.
Estos
periférico.
cambios,
La
y
podido
estructurales
pueden
de
de
l a s células
metabólicos
estos
de
como l a s
ser detectados
identificación
y
a
y de
nivel
cambios
ha
constituido l a base de l o s denominados marcadores tumorales.
El
primer
marcador
tumoral
fue identificado
en Gran
Bretaña hace unos 140 años, se trataba de una proteína en l a
orina de un paciente que sufría un
huesos".
Esta
proteína
la
"reblandecimiento de l o s
determinó
el
Dr.
Henry
Bence-Jones, y a l cabo de más de 100 años sería i d e n t i f i c a d a
como
la
cadena
ligera
52
de
las
inmunoglobulinas.
M. Sisteré
cáncer de mama
característica d e l mieloma múltiple.
El
término marcador
Nagell^^
tiamoral
ha sido
definido
por Van
como unas sustancias producidas selectivamente por
las células de los tumores malignos y
liberadas a l e x t e r i o r
en cantidades suficientes que permitan su dosificación.
Actualmente e l término
sustcincla
células
de
carácter
marcador tumoral se a p l i c a a toda
bioquímico
tumorales o por e l
producida bien
orgcinismo d e l
presencia puede ser detectada en
e l suero
por l a s
huésped,
y cuya
u otros líquidos
biológicos, comportándose como indicador o señal a d i s t a n c i a
de l a presencia de una neoplasia.
Un
marcador
tumoral
ideal,
debe
presentar
una
alta
s e n s i b i l i d a d y e s p e c i f i c i d a d , que permita detectar realmente
los
pacientes afectos
sujetos
sanos
benignas.
célula
o
de
de cáncer y d i f e r e n c i a r l o s
aquellos
Para e l l o , debe ser
transformada, o
que
padecen
por l o s t e j i d o s
del
desarrollo
aplicada,
mismo.
Además,
de l a neoplasia,
huésped como
en concentraciones que
deben ser proporcionales a l a masa d e l tumor
del
afecciones
producido y excretado por l a
respuesta a l a presencia d e l tumor,
diferenciación
de l o s
y a l grado de
modificaciones
debidas o no
en
el
a l a terapéutica
deben r e f l e j a r s e en forma de cambios sustanciales
en l a s concentraciones del marcador.
Aunque realmente un
marcador
tumoral i d e a l
que presentara una concentración sérica
una
pequeñísima
masa
tumoral,
sería aquel
elevada a
pudiéndose
pesar de
utilizar
para
diagnóstico precoz o de r e c i d i v a .
En l a
como un
práctica
un
marcador tumoral
indicador bioquímico
53
usualmente
puede ser definido
encontrado
en e l
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
suero
a
una
concentración
anormal
en
presencia
de una
neoplasia.
2a.- Tipos de marcadores tumorales
Se pueden d i v i d i r en dos grandes categorías.
A. - Derivados d e l tumor.
B. - Asociados a l tumor.
A.- Derivados d e l TumorSon moléculas
producidas
por
l a s propias
células d e l
tumor.
Entre e l l o s están:
Antígenos Oncofetales: Alfafetoproteína, CEA.
Enzimas e isoenzimas: NSE.
Productos derivados de oncogenes.
Hormonas; B-HCG, ACTH, C a l c i t o n i n a .
Proteínas
específicas
de
tejidos:
PAP,
PSA,
Lactoalbúmina.
MucinaSy qlicoproteínas y glicolípidos.
Hasta
hace
poco
se
pensaba que l a s células tumorales
adquirían l a capacidad de
no
se
podían
sintetizar
detectar
aplicando técnicas de
en
nuevas sustancias que
l a s células
normales,
a l t a s e n s i b i l i d a d (RÍA,
anticuerpos monoclonales,
se ha podido
pero
ELISA,...) y
demostrar que estas
moléculas están presentes en l a s células normales en c i e r t o s
estadios de diferenciación o a bajos n i v e l e s de expresión.
54
M. Sisteré
Cáncer de mama
B.- Marcadores i\soclados a l Tumor.
Son sustancias producidas por e l organismo d e l huésped en
respuesta a l desarrollo d e l tumor. Son elementos normalmente
presentes en
se
l a circulación pero cuya
incrementa
concentración sérica
considerablemente
en
enfermedades
degenerativas, crónicas y cancerosas.
Algunos de e l l o s son:
Ferritina.
Fosfohexosa
isomerasa.
Inmunocompleios
circulantes.
• Proteínas de fase aguda.
Otras
proteínas asociadas
inmune; B-2
a
l a respuesta
Microglobulina,
d e l sistema
Neopterina,
TNF,
e
ínterleukinas,
2b.- Interpretación de l o s resultados
Al
interpretar
determinación de
los
datos
marcadores
forma c u a n t i t a t i v a ,
suministrados
tumorales,
se ha de
por
la
hacer de
relacionándolos con una s e r i e de hechos
clínicos.
Para
una correcta
interpretación de l o s resultados son
decisivas varias cosas:
a/ Número de Células Productoras:
A mayor número de células neoplásicas,
marcador habrá en
sangre.
mayor cantidad de
Aunque dependiendo d e l
lugar de
síntesis I n t r a c e l u l a r e l mecanismo de paso d e l marcador a l a
circulación estará más o menos d i f i c u l t a d o .
b/ Cinética Tumoral:
55
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
La
velocidad
de
crecimiento
d e l tumor,
e l grado de
diferenciación y l a tasa de recambio c e l u l a r , son parámetros
a tener en cuenta a l a hora de v a l o r a r los resultados.
En tumores
usarse
con gran
velocidad
como marcadores
de
tumorales
crecimiento, pueden
l a t i m i d i n kinasa, que
es un marcador de duplicación c e l u l a r .
c/ Metabolismo d e l Marcador;
Es
necesario
marcador.
conocer
Alteraciones de
l a s vías
de
metabolismo d e l
estas vías
serían
una causa de
falsas elevaciones séricas.
El
antígeno
pacientes
SCC,
se
elimina
con i n s u f i c i e n c i a
por vía u r i n a r i a ,
renal
daría
en
valores f a l s o s .
Igual sucede con l a B-2-microglobulina.
El
CEA
y
e l CA
19.9
se
eliminan
por vía
biliar,
aumentando en l a s coléstasis.
d/ Vida Media;
Se r e f i e r e a l tiempo necesario para
que l a concentración
sérica de un marcador tumoral disminuya a l a mitad.
Va desde unas horas en l a B-HCG, a unos días en e l CEA.
2c.-
Uso clínico de l o s marcadores tumorales
a/ Marcadores Tumorales de A l t a E s p e c i f i c i d a d ;
Son
aquellos
fisiológicas
que
pero
se
pueden
presentan
detectar
claras
en
situaciones
diferencias
de
concentración ante l a presencia de un tumor maligno.
Ejemplos
embarazada
son; La
o en
B-HCG.
un varón,
S i se eleva en una mujer no
es dato específico de
tumor de
ovario o de testículo.
56
M. Sisteré
Cáncer de mama
La C a l c i t o n i n a , en e l cáncer medular de t i r o i d e s se eleva
notablemente,
s i no e x i s t e ningún cáncer se mantiene dentro
de unos n i v e l e s normales.
b/ Marcadores tumorales de e s p e c i f i c i d a d Intermedia:
Se pueden
I n c l u i r l a mayoría,
CEA,
A-FP,
CA 12.5, CA
15.3.
Es posible detectarlos a
sanos
y a niveles
baja
discretamente
concentración
elevados
en sujetos
en enfermedades
benignas.
c/ Marcadores Tumorales de Baja E s p e c i f i c i d a d :
Son de Interés para e l c o n t r o l evolutivo de pacientes con
neoplasias.
Suelen
haber
niveles
elevados
en
otras
patologías no cancerosas.
Algunos de estos marcadores son l a PHI
y l a LDH (enzimas
glicolíticas).
2d.- Aplicación en l a práctica clínica
Los
marcadores
parámetros útiles
tumorales,
para
no
pueden
usarse
e l diagnóstico de las
como
neoplasias y
menos en programas de detección precoz.
Sin embargo a l
buscando
neoplasia,
para
diagnosticarse un cáncer,
recopilar
para
que
de
se debe seguir
l a máxima
información
este
podamos
modo
de
esa
realizar
un
tratamiento de l a forma más i n d i v i d u a l i z a d a posible.
Así l a información p r i n c i p a l d e l marcador
práctica clínica,
valoración
de
la
es
l a confirmación d e l
e f i c a c i a d e l tratamiento
tumoral
en l a
diagnóstico, una
y un indicador
precoz de l a s r e c i d i v a s .
57
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
a/
Grupos de A l t o Riesgo; Existen neoplasias productoras
de un determinado marcador tumoral, que podría ser u t i l i z a d o
para
realizar
un
diagnóstico
precoz
de
l a misma.
Son
ejemplos de ésto:
La C a l c i t o n i n a en e l carcinoma medular de T i r o i d e s .
La Alfa-fetoproteína en los pacientes con c i r r o s i s que
desarrollan un Hepatoma.
La B-HCG que i d e n t i f i c a
l a degeneración de
l a mola a
coriocarcinoma.
b/
La
confirmación
marcadores tumorales
escasa,
de
sospecha;
La
utilidad
aplicados a l diagnóstico
de cáncer es
debido a l a baja s e n s i b i l i d a d que presentan
estudios
precoces
embargo con una
confirmar
utilidad
observa un
sospecha
el
desconocido,
desarrollo
de
la
h i s t o r i a clínica sugestiva
la
en
del
clínica.
diagnóstico
es e l
caso
síndrome
de
También
de l o s
en l o s
neoplasia.
Sin
de tumor pueden
puede
ser
de
l a s neoplasias
de
origen
l o s pacientes en
los
que se
paraneoplásico
o una
metástasis, s i n
l o c a l i z a r s e e l tumor p r i m i t i v o .
En
pacientes diagnosticados
marcador
tumoral,
ya
que un
se valorará los
mayor n i v e l ,
da
niveles de
muestra de
encontrarnos en un estadio más avanzado de l a enfermedad.
Cuando
l o s niveles de
son muy elevados
una
mala
recidivas.
determinados marcadores tumorales
preoperatoriamente se
correlación
Es e l
con
caso
la
d e l CEA,
ha podido observar
supervivencia
MCA,
BCM,
o
índice de
CA 15.3 en e l
cáncer de mama^'* o l a PHI en e l cáncer de pulmón.
Una vez e l tumor p r i m i t i v o ha sido extirpado, e l paciente
es
sometido
a
una
serie
58
de
controles
periódicos.
M. Sisteré
La
Cáncer de mama
p e r s i s t e n c i a de niveles de marcador tumoral
15-20
días
manifiesto
después
de
la
elevados, entre
intervención,
pondrían
que l a intervención no ha sido todo
de
lo r a d i c a l
que se hubiera deseado.
S i después de l a intervención, inicialmente disminuyen,
para
volver
a aumentar más
tarde,
se ha de sospechar una
r e c i d i v a tumoral.
En e l cáncer de mama
permiten detectar
las metástasis
e l CEA y CA 15.3
en más de un 60%, con
anterioridad a cualquier otro método diagnóstico.
E l TPA se ha catalogado como e l mejor de los marcadores
tumorales.
La asociación
asociación.
de TPA-CA
La combinación
de
15.3 como
CEA-TPA-CA
l a mejor
15.3 aumenta
sólo ligeramente l a s e n s i b i l i d a d y e s p e c i f i c i d a d conseguidas
por l a combinación TPA-CA 15.3.^^
Otra
combinación de gran ayuda para e l
seguimiento d e l
cáncer de mama l a forman CA 125 y CA 27.29.^^
E l CA 15.3
se asocia a los más
pronóstico d e l cáncer de mama
la
afectación
ganglionar.
importantes
factores de
como son e l tamaño
En contra,
no
tumoral y
se ha
podido
observar ninguna asociación de este t i p o n i con e l CEA y n i
e l TPA.^4
Para l o s cánceres de mama con ganglios negativos,
han establecido unos
E l Ki-67,
de
indicadores de pronóstico aceptables.
se correlaciona bien con e l grado nuclear y n i v e l
recidivas t u m o r a l e s . E l
anticuerpo Ki-67,
Por l o
mecanismo
de actuación d e l
es localizando un antígeno
l a s células de cáncer
celular.
no se
de mama,
que este
d e l núcleo de
asociado a l a proliferación
anticuerpo
Ki-67,
confirma su
e s p e c i f i c i d a d para l o c a l i z a r células en proliferación.^^
59
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
Un
nuevo
marcador
e s p e c i f i c i d a d para
tumoral
e l cáncer
que
de mama,
s e n s i b i l i d a d para detectar lesiones
posee
una a l t a
pero
una pequeña
i n c i p i e n t e s cancerosas,
es e l CA 549.^9
En l a
Enfermedad de Paget de
secreción
por e l
pezón,
l a mama;
podría
marcador tumoral llamado Calam 27,
células
carcinomatosas
de
a l presentar una
ser de gran
capaz
interés un
de d i s t i n g u i r l a s
l a s mesoteliales en
exudados
serosos de pacientes con cáncer.
La u t i l i d a d del marcador tumoral cuando
halla
en fase
metastásica,
es
l a enfermedad se
l a de valoración
de l a
e f i c a c i a d e l tratamiento.
Aunque no se t r a t a de un marcador tumoral,
l a expresión
del Complejo Mayor de Histocompatibilidad en l a s
un
tumor parece
activación
ser que tiene un efecto
de diferentes
determinación
iría
a
partes
favor
células de
selectivo
d e l sistema
de una mejor
en l a
inmune, su
respuesta d e l
huésped frente a l a enfermedad neoplásica.^-'Resumiendo,
tumorales
e l valor que se podría dar a
es e l de gran
extensión de
l a enfermedad
quirúrgico en l o s tumores
utilidad
o la
para
los marcadores
determinar l a
e f i c a c i a d e l tratamiento
en estadio
adelante son útiles para diagnosticar l a s
locorregional. Más
recidivas locales
o a d i s t a n c i a y valoración de l a terapéutica.
60
M. Sisteré
Cáncer de mama
3.-
Factores pronósticos de t i p o histológico
Desde que Broders
grados
Introdujo
l a Idea
de los diversos
de Invasión cancerígena en 1920, se ha centrado e l
Interés en buscar una s e r l e de factores histológicos
cáncer
de mama
que nos a d v i r t i e r a n
en e l
de l a potencialidad
tumoral de una determinada masa cancerosa.
Algunos
(1950),
investigadores
Bloom
correlacionar
como
Haagensen
and Rlchardson'^2''^2(1957,
diversos
parámetros
(1933),
1962), intentaron
histológicos
supervivencia de l a enfermedad maligna;
Bloom
con
la
aunque a l p r i n c i p i o
se l e dio poca importancia, actualmente vuelve a tenerse muy
en cuenta.
Estos factores pronósticos de t i p o histológico son:^^
3a.- Tipo histológico d e l tumor
Los
carcinomas
ductales
malignidad que l o s demás,
medular, p a p i l a r
Inclusive
carcinoma
presenta
infiltrantes
mayor
entre e l l o s e l carcinoma tubular,
o coloide.
algunos tumores
medular
de mama
afectación
supervivencia y
tienen
especiales,
como
con i n f i l t r a d o
ganglionar,
una poquísima
tiene
incidencia
e l llamado
l i n f o i d e , que
una
enorme
de r e c i d i v a s a
pesar de l a afectación ganglionar.
61
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
Comparando l a supervivencia
un
o e l índice
carcinoma ductal i n f i l t r a n t e
con
otros tipos
de
tumores
de r e c i d i v a s de
s i n afectación ganglionar,
con menos
de
tres
ganglios
afectados, no existe una d i f e r e n c i a s i g n i f i c a t i v a .
3b.- Grado histológico^^
Se tiene en
cuenta
tres
parámetros,
hasta tres puntos a cada parámetro,
final
l a suma
del total
de
dando un v a l o r de
obteniéndose como v a l o r
puntos
asignados
en
cada
apartado.
Formaciones Tubulares;
La
formación ' de
células
agrupadas
túbulos
alrededor
o
de
estructuras
acinares, con
un
central,
espacio
es
indicador de un a l t o grado de diferenciación.
Distribución de l o s puntos:
1
punto: La
sección muestra una formación
tubular
bien
definida:
2 puntos: La foirmaclón de túbulos es moderada.
3 puntos: Hay poca o no hay formación tubular.
PleomorfIsmo:
E l pleomorf ismo consiste en irregularidades en e l tamaño,
forma
y/o
estructuración
del
núcleo
de
l a s células
cancerígenas.
Distribución de l o s puntos:
62
M. Sisteré
Cáncer de mama
1 punto: E l
núcleo
es
uniforme
en
tamaño,
forma
y
estructuración.
2 puntos: Moderada
variación
en
tamaño,
forma
y
estructuración.
3 puntos: Pleomorfismo marcado.
Mitosis;
Se i d e n t i f i c a n células
mitosis,
en mitosis con
c l a r a s figuras de
ignorándose l o s núcleos picnóticos. Observación de
l o s bordes
tumorales donde se
encuentra
t e j i d o neoplásico
invasivo.
Distribución de puntos;
1
punto: Alguna figura de mitosis ocasional con un campo
microscópico de gran aumento.
2 puntos; Dos o tres figuras de mitosis en l a mayoría de
campos observados.
3 puntos: Gran número de figuras de mitosis.
La valoración global del
grado histológico es:
Grado I = 3, 4 ó 5 puntos.
Grado I I = 6 ó 7 puntos.
Grado I I I = 8 ó 9 puntos.
3c.— Tamaño tumoral
Para tumores de un tamaño menor o i g u a l
la
i n c i d e n c i a de metástasis
63
a
1 centímetro,
nodal suele ser
muy
parecida.
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
fijándose
entre un
centímetro
de
Incidencia de
11-15%.
diámetro,
Cuando e l
hasta
los
tumor
dos
metástasis v a r i a entre
sobrepasa e l
centímetros,
la
un 25-43%, aumentando
considerablemente por encima de los dos centímetros.
3d.- Grado nuclear"^^ "^^^
Este f a c t o r
pronóstico de t i p o
explicar l a
agresividad de
diferentes
conformaciones
histológico ha intentado
un determinado
nucleares
tvimor según l a s
de
las
células
observadas en l a s preparaciones anatomo-patológicas.
Se
distinguen tres grados;
Grado
I
= Núcleo
pequeño,
uniforme,
diferenciado
y
con
fina
cromatina.
Nucléolo
contomo
tinción
imiy
bien
de
la
pequeño
o
Imperceptible.
Grado
II
= Núcleo
con
contomos
irregulares,
gruesa
tinción de cromatina y nucléolo prominente.
Grado I I I
= Núcleo
grande,
hipercromática,
pleomorf o,
cromatina
débiles bordes
nucleares y
nucléolo prominente.
La morfología
diversos
estadios
nuclear está
del
cáncer
64
claramente
de
mama,
alterada
en l o s
habiendo grandes
M. Sisteré
Cáncer de mama
diferencias de los casos tempranos respecto a l o s avanzados.
A pesar de todo algunos autores no consideran este parámetro
v i a b l e como para predecir e l comportamiento d e l cáncer en l a
3e.- Embolización linfática peritumoral
Los
del
pacientes en los que podamos observar
lecho
vascular
linfático
por parte
una invasión
de las células
neoplásicas en forma de émbolos, tienen una mayor frecuencia
de recurrencias e índice de muertes.
La determinación de l a invasión
e l cáncer
de mama,
puede
pacientes
que se dude
linfática peritumoral en
s e r de gran
a
l a hora
eficacia
en l a s
de administrar
un
tratamiento sistémico coadyuvante a l l o c a l .
3f.-
Invasión
periTienT-al
y
de
vasos
sanguíneos
detectada en masa tumoral
La simple afectación
del
árbol
vascular
nervioso periférico
por extensión l o c a l
intratumoral,
de
malignidad.
así como,
existente en e l seno
parte de células cancerosas
Tanto
es considerado
si
existe
o embolización
d e l sistema
d e l tumor, por
como un marcador
afectación
ganglionar
concomitante como s i no.
Se ha intentado estudiar
por parte de
los l i n f o c i t o s
65
s i l a infiltración d e l tumor
t i e n e alguna
relación
con e l
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
pronóstico d e l cáncer de mama; pensando en una mejor defensa
del huésped
frente a l a
agresión
comentaba en trabajos
de
elevado
tumores
número
llnfocltos,^'*
de
neoplásica,
los años
70, a l verse
estaban
que un
Invadidos
por
pero aún sigue siendo una I n c ó g n i t a . A u n q u e
recientemente se ha demostrado que l o s tumores
expresan
t a l como se
los antígenos de c l a s e I
Hlstocompatlbllldad,
presentan
de mama que
d e l Complejo
una
gran
Mayor de
Infiltración
Intratumoral de l l n f o c l t o s .
A
pesar
técnicas
(estudios
de l a s mejores,
para
últimas
y
pronosticar
l a evolución
morfométrlcos,
citometría
Inmunohlstoquímlca,
más s o f i s t i c a d a s
de un cáncer
de
flujo,
técnicas de hibridación de DNA), con e l
simple microscopio óptico, parece que hay más que s u f i c i e n t e
para predecir l a s r e c i d i v a s en e l
cáncer de mama,
según un
trabajo reclentíslmo.
3g.- Grado mítótico'^'^^^^
Grado I = De O a 10 figuras de m i t o s i s .
Grado I I = De 11 a 20 f i g u r a s de m i t o s i s .
Grado I I I = Más de 21 f i g u r a s de m i t o s i s .
66
M. Sisteré
Cáncer de inania
3h.- Otros paT-áTnp>i:ros histológicos de pronóstico
Algunos otros datos obtenidos d e l estudio
l o s tumores que
histológico de
han demostrado ser de interés con relación
a l pronóstico d e l cáncer de mama son:^^'^^
Necrosis Intratumoral.
Calcificación Intratumoral.
Infiltración Dérmica.
Circunscripción Tumoral (borde tumoral).
Invasión Pared Torácica.
Relación Núcleo-Citoplasma.
Relación Núcleo-Nucléolo.
67
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
4.-
4a.-
Oncogenes
Nomencl a tur-a
Inicialmente se
emplear
definirá
c i e r t a s palabras que
se van a
o tienen relación con este tema.
Gen.información
Secuencia
de
necesaria
nucleótidos
para
que
l a síntesis
constituye l a
de
una
cadena
polipeptídica.
Locus.- Posición sobre un cromososma en l a cual reside e l
gen de un carácter determinado; e l locus puede estar ocupado
por uno o cualquiera de l o s a l e l o s d e l gen.
Codón.-
Triplete
de
nucleótidos
que
representan
un
aminoácido o señal de terminación.
Alelo.-
Una de l a s varias formas a l t e r n a t i v a s
de un gen
que ocupa un determinado locus en un cromosoma.
A l e l o dominante.individuo
A l e l o que determina e l fenotipo
heterozigótico,
que
tiene
además
otro
de un
alelo
recesivo.
Clon.-
Células o moléculas idénticas que proceden de una
única célula o molécula a n c e s t r a l .
Amplificación.secuencia
Producción de copias
cromosómica.
Pueden
adicionales de una
hallarse
tanto
en
intracromosómico como DNA extracromosómico.
68
M. Sisteré
DNA
cáncer de mama
Mutación.- Todo cambio en l a secuencia d e l DNA genómico.
Supresión.-
Producción
efectos de una mutación
de cambios
que eliminan l o s
s i n r e v e r t i r e l cambio
o r i g i n a l en
e l DNA.
Expresión.-
Aparición en l a p e r i f e r i a
sintetizadas a p a r t i r
de l a s sustancias
de l a l e c t u r a de un/os determinado/s
gen/es.
4b.-
Conceptos básicos
Se c a l c u l a que e l número de genes humanos que se conocen
está cercano a l o s 100.000,
función e s p e c i f i c a
interrelacionan
pero l o que no conocemos es l a
que desempeñan
en procesos
de
en l a célula,
división
y
y como se
desarrollo
celular.
Todo
gen implicado
haciendo que
en l a transmisión
de señales,
una célula se comunique con e l entorno
otras células,
puede transformarse en oncogén
o con
mediante una
mutación.
La
primera
asociación
de un oncogén
específico fue l a translocación del c-abl
con un cáncer
y
l a s leucemias
mieloide crónica y linfocítica aguda.
La división c e l u l a r es continua y susceptible de mutación
y por tanto de formación de procesos tumorales.
E l crecimiento d e l e p i t e l i o normal de l a mama es regulado
por
un sistema
de polipéptidos . y
hormonas esteroideas.
Cambios en l o s oncogenes d e l núcleo, pueden a l t e r a r e l c i c l o
celular
normal.
Modificaciones
69
en
los
factores
M. Sisteré
de
Citometría de F l u j o
crecimiento,
sus
receptores
o
el
segundo
mensajero
I n t r a c e l u l a r , pueden estimular e l crecimiento no regulado.
Actualmente
l o s Investigadores
descubrir e l papel que juegan
centran
su
atención en
l o s oncogenes en
l a biología
de las células cuando éstas no están mutadas. Pues e l cáncer
se origina en células
casuales
o
normales que por causa de mutaciones
propiciadas,
pueden
degenerar
en
un proceso
maligno.
En los cánceres h e r e d i t a r i o s e l primer cambio mutacional
está
genéticamente programado.
Los
siguientes son cambios
somáticos, que ocurren a l azar. Los cánceres esporádicos por
tener
que r e a l i z a r s e
dos
mutaciones
a l menos,
de forma
casual, surgen en edades más avanzadas de l a vida.^^
La gran mayoría de tumores
sea,
formados
por poblaciones celulares
progenie de una sola célula
otras,
requlrléndose
desarrollo
situados
humanos son monoclonales, o
de
que nace
a l menos
una neoplasia.^''
dentro
o en
estructuración de
ADN
mutaciones
piensa
l a s proximidades
subyacentes
por l a
superponiéndose a l a s
dos
Se
dominadas
a
para e l
que l o s genes,
de
l a s zonas de
dichas alteraciones,
intervienen en e l d e s a r r o l l o de tumores.
Las
mutaciones que
causan unos
mutación
cambios
activan los oncogenes son mínimas y
extremadamente
pequeños.
es necesaria para que una célula
Más
llegue
de una
a formar
una clona maligna.
Al
ser e l cáncer
variables,
de
una enfermedad de etapas
múltiples ^
un único oncogén no puede por s i solo, ser capaz
propiciar
paulatino de
un
un
tumor.
Se
en
e l desarrollo
tumor intervienen entre 3
y 5 oncogenes.
70
cree
que
M. Sisteré
Cáncer de mama
pasando l o s mismos oncogenes por diversas etapas a
de
l a evolución
específicos
tumoral.
puede
La
función
s e r alterada
cromosómlcas o mediante
de algunos
mediante
repllcaclón
l o largo
genes
translocaclones
génlca.^^
Se han descubierto l a s translocaclones cromosómlcas como
un suceso temprano en l a formación de un tumor.
Ejemplos
La
de e l l o son:
translocación entre l o s cromosomas
9 y
22, que se
encuentra en l a leucemia mieloide crónica.
En
1/3
de l o s liposarcomas
existen
translocaciones
implicando a l o s cromosomas 12 y 16.
En
1/4
de
l o s leiomiomas
se encuentran alteraciones
genéticas afectando a l o s cromosomas 12
(trlsomía), 14 y
6, así como pérdidas d e l brazo largo d e l cromosoma 7.
En sarcomas sinoviales se han encontrado translocaciones
en
l o s cromosomas
18 y X,
l a mayoría de l a s veces de
forma recíproca.
En
rabdomiosarcomas se han i d e n t i f i c a d o translocaciones
entre l o s cromosomas 2 y 13.^^
Alteraciones
importancia
del
cromosoma
11
y
17, tienen
gran
en e l cáncer de mama.^^ (Fig- 3)
Las anormalidades cromosómlcas,
tumores malignos,
e l estudio
no son exclusivas de l o s
cromosómico
de
l o s tumores
benignos muestra una elevada frecuencia de éstas.
71
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
4c.-
Función de l o s oncogenes
Pueden
funcionar
crecimiento,
como
enzimas,
como receptores
como factores
de
de
como
factores
transcripción o
como
factores
de
de crecimiento,
reguladores
de l a
expresión genética.
La proliferación y diferenciación de l a s células normales
están
reguladas por señales
a
celular.
Los factores de crecimiento a l unirse a receptores
de l a s u p e r f i c i e
señales para
l a activación,
celular.
señal de
general,
una
La
alteraciones
transformación
replicación
y diferenciación
regulado, podría dar
l o s factores
de sus receptores u
de
también
neoplásica.
oncogenes
tienen
crecimiento o
de
que
algunas
actividad
Se
ha
observado
proteínas
similar
sus . receptores.
supondría que los oncogenes,
crecimiento en
otros elementos, induciéndose
células cancerosas segregan algunos factores
nuevos,
l a superficie
de l a s células diana, envían
crecimiento no
de
de
l a unión de
de
lugar a
receptores
de
factores
específicos
crecimiento
procedentes
de crecimiento
s i n t e t i z a d a s por
a
'
que l a s
l o s factores
'
Por
de
l o que se
pueden transformar l a s células
a l t r a n s m i t i r una señal no regulada
de crecimiento c e l u l a r ,
ocasionando e l crecimiento incontrolado y
anómala que distingue e l estado
l a diferenciación
canceroso.
Pese a a t r i b u i r s e l a a n t e r i o r función completamente a l o s
oncogenes,
cada vez
son más l o s investigadores
que opinan
debe haber una asociación entre l a activación
de un oncogén
y l a inactivación de un antioncogén para que
tenga lugar l a
72
M. Sisteré
Cáncer de mama
formación de un tumor.
Los diversos oncogenes estudiados parecen tener
utilidad
como
factores
pronósticos
en
el
una gran
cáncer
y
particularmente relacionados con e l de mama. Se han mostrado
como tumores
más agresivos
genotipo genes
cromosoma
c-erb-A,
p450,106
Pese
como e l p53,
17,95,96,97,98,
e l c-erbB,102
e l c-mycl07
aquellos
que expresan en su
situado en e l brazo
el
HER-2/neu,99^100^el
e l c-erb-B-2,102/103,104,105
QI
y e l lnt-2.108,109
ha haber mayoría de estudios
oncogenes como
corto d e l
que orientan
factores de pronóstico existen
a los
algunos que
aún ponen en duda su verdadera u t i l i d a d . H O , m
4d.- Protooncogenes
La idea de protooncogén partió de l a creencia
de que l o s
r e t r o v i r u s eran los responsables de l a formación de tumores
en
animales y
setenta,
posiblemente en e l hombre.
se comprobó
que l o s genes
En l o s años
de l o s retrovirus
responsables de l a transformación c e l u l a r
eran en realidad
genes celulares modificados por e l virus
a l secuestrarlos
d e l genoma de l a célula
a l a que se i n f e c t a .
desprende que había un gen normal en cada
De l o que se
célula que poseía
l a capacidad de convertirse en oncogén. Motivo por e l que se
ha denominado
protooncogén
a un gen normal
con potencial
cancerígeno.
Los
vírico,
oncogenes activados
por v i r u s ,
no
son de origen
sino genes normales de l o s que e l v i r u s
73
se apropia
M. Sisteré
Citometria de Flujo
durante
su
oncogenes
multiplicación
de
retrovirus
genes celulares normales,
en
l a célula
guardan íntima
donde
tienen
a n f i t r i o n a . Los
relación
con l o s
funciones v i t a l e s ,
adquiriendo e l potencial cancerígeno después de alteraciones
funcionales importantes.
En e l mecanismo de funcionamiento de l a s células existen
genes
denominados
protooncogenes
que
genes de proliferación c e l u l a r y que
simple
mutación
normal
de
Esto
es
en
oncogenes,
l a célula,
debido
específicamente
se
comportan
como
pueden convertirse por
alterando
e l desarrollo
convirtiéndola en cancerígena.'•'•^^
a que
l a s proteínas
l o s mecanismos que
oncogénicas alteran
regulan e l crecimiento
celular.
4e.- Antioncogenes
Como
del
l o s oncogenes
crecimiento
adivinar
dominantes
son genes estimuladores
inadecuadamente
l a existencia
de
activados,
otra
clase
de
se puede
oncogenes
denominados recesivos o antioncogenes.
Los oncogenes recesivos o supresores
funcionan limitando
e l crecimiento c e l u l a r y l a diferenciación provocada por l o s
lio
oncogenes. -^-^^
E l primer oncogén recesivo que se aisló fue e l gen Rb d e l
retinoblastoma.
Otros antioncogenes son e l RBl, antioncogén reconocido en
osteosarcomas y sarcomas de t e j i d o s blandos,
e l p53 también
puede actuar como un antioncogén. Realmente l a forma i n i c i a l
d e l p53
es un gen supresor tumoral,
74
que mediante una s e r i e
M. Sisteré
cáncer de masaa
mutaciones
se convierte en un oncogén.88/95,113
Un gen denominado " p r o h i b i t l n a "
cromosoma 17ql2-21,
se ha
este gen, probablemente un antioncogén,
v i s t o asociado
desarrollo
y
ha sido encontrado en e l
con l a
progresión
interrupción
tumoral
de
o supresión d e l
algunos
cánceres de
mama,
Con
nueva
la
aparición de
idea
actuarían
sobre l a
como
ocasionado por
formación
controladores
los
darían lugar a
Aunque
parece
del
del
oncogenes.
antloncogenes llegaría a
que
l o s antloncogenes,
La
cáncer.
Estos genes,
crecimiento desmesurado
desactivación
dejar s i n control a
l a formación de un
ser
ha surgido una
necesario
de estos
l o s oncogenes
proceso neoplásico.
inactivarse
más
de
un
antioncogén para que se i n i c i e una neoplasia.88
4f.-
Aplicaciones terapéuticas
Hasta que no se conozca e l completo funcionamiento de una
célula normal,
no será
posible diseñar unos
protocolos de
ataque a l a célula tumoral.
E l diagnóstico de l o s oncogenes tiene en l a actualidad un
v a l o r limitado,
pues hoy por hoy no
hay
manera
alguna de
i n a c t l v a r un oncogén.
E l futuro de los oncogenes puede ser fantástico. Se podrá
identificar
y
controlar
los
factores
ambientales
y
n u t r i c i o n a l e s que puedan causar o prevenir e l cáncer.
A l conocerse los mecanismos moleculares empleados por l o s
oncogenes para l a transformación maligna,
75
se podrá o r i e n t a r
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
y d i r i g i r l a actuación farmacológica.
La
determinación
alteraciones
añadirá
la
neoplásicas en
nuevas
interpretación de
d e l genoma
de
en
anatomía
de
las
estirpes celulares específicas
dimensiones
al
l a s implicaciones
la
molecular
formación
diagnóstico.
La
biológicas específicas
de cada tumor será
e l mayor
hallazgo de l a investigación de l o s oncogenes, y no tan sólo
la
identificación
de
las
alteraciones
específicas
del
genoma.
La
clasificación
de
las
alteraciones específicas y
la
enfermedades
detección
en
función
de
de modificaciones
moleculares parecen dos metas a conseguir pronto.
Con
de
l o s mecanismos
moleculares que producen l a transformación
y diferenciación
celular,
el
progresivo
conocimiento
es de esperar que aparezcan
selectivamente e l
fármacos que bloqueen
crecimiento incontrolado
y
ayuden
regeneración controlada de t e j i d o s .
76
M. Sisteré
a la
Cáncer de mama
YNZ22
P63
ERB B2
RAR alfa
H0X2
INT4
21.3
NQFR
QH1
QH2
CMM86
NM23
PKC
Figura 3.- CROMOSOMA 17
Genes implicados en el cáncer de mama
77
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
D.-
1.-
CICLO CELULAR
Generalidades
Hace más de 100
años que conocemos l a división mitótica
como e l mecanismo básico de l a reproducción c e l u l a r .
Las células se multiplican, organizándose de una manera u
otra
según
e l lugar
destinado,
para
así
realizar
una
determinada función.
Para entender e l normal funcionamiento de
importante
e l conocer l o s
pasos
una célula, es
de -una división
y los
mecanismos que l a regulan.
Se había pensado que l a s
nuclear,
células
permanecían
en reposo
hasta l l e g a r l a hora de l a división, momento en e l
c u a l , había un enorme movimiento en e l material cromosómico,
con e l f i n de duplicarse y formar unas nuevas células. Ahora
se ha
podido
"Interfase",
l o estipulado,
saber
que
durante
este
período denominado
existe una intensa a c t i v i d a d , contrariamente a
preparándose
e l material
nuclear
para l a
mitosis.
Las células pueden permanecer en 4 estados:
^
1.- Estado p r o l i f e r a t i v o con capacidad de formar colonias
(clonogénicas).
78
M. Sisteré
cáncer de mama
2. - Estado
p r o l i f e r a t i v o pero
s i n capacidad
de formar
colonias (no clonogénicas).
3. - S i n actividad
proliferativa,
pero
con
capacidad
sin
capacidad
clonogénica.
4. - S i n
capacidad
proliferativa
y
está
como
clonogénica.
El
Ciclo
Celular,
existente entre e l f i n a l de
definido
e l intervalo
l a mitosis de l a célula madre,
hasta e l f i n a l de l a mitosis de l a / s célula/s h i j a / s .
E l c i c l o de repllcaclón c e l u l a r fue d e s c r i t o
vez
en
1951, usándose
sintetizaban
muchos
DNA e l
(Timidina
como marcador
32p^
tritiada,
de
por primera
l a s células que
actualidad existen otros
DAPI,
loduro
de Propidium,
naranja de acridina) que han reemplazado a este marcador.
Se sabe que e l c i c l o c e l u l a r de l a s células con capacidad
p r o l i f e r a t i v a , se divide en cuatro f a s e s : ( F i g . 4)
1/ Fase de presíntesis o postmitótica.-
GO-Gl.
2/ Fase de síntesis.-
S.
3/ Fase de postsíntesis o postmitótica.-
G2.
4/ Fase de mitosis.-
Apoyándose
comentadas,
en
se
las
M.
fases
del ciclo
puede d i v i d i r a una
celular,
población
antes
c e l u l a r , en
células que s i n t e t i z a n DNA y células que no s i n t e t i z a n DNA y
no están en mitosis.
79
M. Sisteré
Citometria de Flujo
La
duración
de
las
fases
constante, siendo muy v a r i a b l e
S,
G2,
y
M
es
bastante
l a duración de l a G l .
Los mejores métodos para i n v e s t i g a r e l c i c l o c e l u l a r son,
l a Autorradiografía y l a Citometria de
F l u j o . Existen otros
métodos más complicados que mediante un scanner
también
(Samba 200)
pueden determinar e l c i c l o c e l u l a r . •'••'•^
En l a figura 5,
se puede ver como se r e a l i z a l a división
del c i c l o c e l u l a r mediante Citometria de F l u j o .
80
M. Sisteré
Cáncer de mama
CICLO CELULAR
FASE S
FASE G2
MITOSIS
DOS CÉLULAS
FASE G1
Figura.-
CÉLULA EN REPOSO
4-
Representación
esquemática
de
un
ciclo
celular
Gl= Fase GO-Gl o Fase de Presíntesis.
S= Fase S. Fase de Síntesis de DNA.
G2= Fase G2. Fase de Postsíntesis o Postmitótica.
M= Fase de M i t o s i s .
81
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
CICLO CELULAR
HISTOGRAMA
160|
. _
FASES DEL CICLO CELULAR
Figura 5.- Representación
de
un
C i c l o C e l u l a r mediante
Citometría de F l u j o .
82
M. Sisteré
Cáncer de mama
2.-
Variabilidad del c i c l o celular
La longitud
del ciclo
células a otro,
varía
fisiológicas como son:
un
t i p o de
Edad, factores de
hormonas, e t c . .
En e l mismo c i c l o c e l u l a r l o s valores
fases
de
e incluso dentro del mismo t i p o , depende de
varias condiciones
crecimiento,
celular,
tienen
una gran
variación,
de
tanto
las diferentes
s i se
t r a t a de
células neoplásicas como s i no. (Ver tabla 1)
La fase GO-Gl d e l c i c l o c e l u l a r está formada por células
en reposo.
Son células que han terminado de d i v i d i r s e y su
material cromosómico está s i l e n t e .
La fase
S,
es a l fase
cual se están realizando
previa
a l a mitosis, durante l a
numerosos cambios, sintetizándose
l a s nuevas cadenas cromosómicas.
La fase G2-M es aquella fase en
l a cual l a célula madre
ya ha alcanzado e l doble de contenido de material genético y
se divide dando lugar a dos células h i j a s .
Un dato a tener en cuenta,
que se muestra en l a t a b l a 1,
es que algunas células normales tienen un c i c l o
corto que l o s tumores de más rápido
Los t e j i d o s normales
c e l u l a r más
crecimiento.
desde e l punto
de
v i s t a cinético
pueden d i v i d i r s e en 4 categorías:
1.para
Tejidos
reemplazar
limitada.
celular.
Hay
con recambio c e l u l a r :
a l a s células
un
Ejemplos
alto
con una
índice
son
Existe una población
las
de
vida
de duración
crecimiento
mucosas
del
y
muerte
sistema
g a s t r o i n t e s t i n a l , v e j i g a , vagina y p i e l .
83
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
Tejidos no p r o l l f e r a t l v o s : Ejemplos son l a s neuronas
y e l músculo
estriado.
Células
muestran
que
poca
o
ninguna
actividad
p r o l i f e r a t i v a durante l a situación estable: Ejemplos
son e l
músculo
liso,
tejido
conectivo, endotelio
c a p i l a r y parénquima hepático.
Proliferación
celular
en
respuesta
a necesidades
fisiológicas: Las células periósticas después de una
fractura
y
las
células
hepáticas
que
quedan
posthepatectomía.
84
M- Sisteré
Cáncer de mama
Duración del Ciclo Celular
In Vivo
Tipo Celular
Te
Cel. Epitel. de Colon
25
Cel. Epitel. de Recto
48
Cel. Epitel. de Estómago 24
Cel. de Médula Osea
18
Cáncer de Céi. Básales 67
Carcinoma Epidermoíde 24
Leucemia Mielob. Aguda 49
Melanoma
46
Cél. Ascíticas Canc.
113
TG1
TS
TG2-
9
33
9
2
36
9
24
20
60
14
10
12
12
19
11
21
19
48
2
6
3
4
12
4
4
7
16
Tc" Duración del Ciclo Celular
TG1« Duración de la Fase GO-Gl
TS= Duración de la Fase S
TG2= Duración de la fase G2-M
Todos los tiempos son en horas
Tabla 1.
85
M. Sisteré
ESTADO DE
CUESTIÓN
Citometria de F l u j o
ESTADO DE l A CUESTIÓN
A.- CITOMETRIA DE FLUJO
1.- Generalidades
La
Citometria
de F l u j o
se empezó a d e s a r r o l l a r
años sesenta en EEUU y Alemania,
cuando
se
ha
investigación
en los
pero ha sido
hace 10 años
logrado l a
aplicación de esta
técnica a l a
biomédica,
gracias
a
los
campos de l a hematología e inmunología,
avances
en los
con e l advenimiento
de los anticuerpos monoclonales.
Los
principios
sencillos.
básicos de
Se debe disponer de una suspensión
material
nuclear.
emplear
diferentes
muestra,
l a Citometria de
sangre,
Para
F l u j o , son
c e l u l a r o de
conseguir esa suspensión,
técnicas,
médula
según
ósea,
de
donde
tejido
se debe
proceda l a
tumoral,
tejido
l i n f o i d e , u otros t e j i d o s .
Las
diversas
digestión
técnicas
enzimática,
han
de
disgregación,
de
tratar
de
triturado
conseguir
y
una
suspensión l o más homogénea posible y con e l menor número de
d e t r i t u s , por l o que deberá f i l t r a r s e cuidadosamente.
86
M. Sisteré
Cáncer de mama
Las
células o partículas se
específicos
fluorescentes,
han de
capaces
teñir con colorantes
de
excitarse
con una
fuente luminosa de a l t a energía.
La
suspensión
convenientemente
inyectada en l a cámara
procesada y
de f l u j o d e l
teñida, es
citómetro. Esta cámara
está diseñada para que l a s partículas pasen una de detrás de
otra,
"en f i l a
dirige
i n d i a " . A estas células o partículas se l e s
perpendicularmente un
dispersando
la
luz
en
haz
todas
de
las
dispersada hacia delante (forward
luz
direcciones.
grados
estructura
La
luz
s c a t t e r a O grados), está
relacionada con e l tamaño de l a célula.
90
monocromática,
La luz dispersada a
( l i g h t s c a t t e r a 90 grados) se relaciona con l a
interna
de
la
célula
y
la
complejidad
citoplasmática.
La excitación de los fluorocromos (material de tinción de
las
partículas),
ocurre en e l
célula y e l haz lumínico,
de
longitud
de
onda
recogida a 90
grados,
seleccionadas
mediante
punto de
resultando l a emisión de
distinta
a la inicial.
espejos
adecuados
fluorocromo
medidas
de
múltiples
puede
ser
Esta luz es
por f i l t r o s
fuentes
unido
(dicroicos),
a
mientras que l a s longitudes
de onda no deseadas son bloqueadas
dispone
una l u z
dirigiéndose l a s longitudes de onda,
detectores fotomultiplicadores,
se
interacción de l a
a
de
luz,
ópticos. S i
más
de
un
l a s células, permitiendo
fluorescentes simultáneas de
varios
parámetros en
una sola célula.
Las
señales
eléctricas
señales d i g i t a l e s ,
analógicas,
procesándose por un
se puedan agrupar en histogramas y así
87
se
convierten
en
ordenador, para que
poder
realizarse e l
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
análisis de los mismos.^^^^
2.- Instrumental
E l p r i n c i p i o básico
de
l a Citometria de
Flujo
es l a
"medición
de cciracterísticas ópticas y fluorescentes de una
célula
partícula i n d i v i d u a l , inmersa en un f l u j o líquido
que
o
interacciona
con
un
haz
de
luz
monocromática",
normalmente un rayo láser. ( F i g . 6, y 14)
E l patrón
pasan
de f l u j o laminar,
una a una;
en
el
que l a s partículas
por delante d e l haz de
l u z , se consigue
manteniendo l a s partículas en una suspensión
líquida que se
inyecta en e l centro de una cámara, rodeada por un f l u i d o de
arrastre
que tiene mayor volumen -y
se
encuentra
a mayor
presión.
E l f l u j o de muestra se reduce a un grosor de 10 mieras, y
l a s células que fluyen por él, se separan alrededor de 2
Es
muy importante
suficientemente
que e l
afinado
fujo
para
que
de
mm.
partículas, esté l o
cada
partícula
logre
contactar con e l haz de luz monocromática. Para e l l o existen
mecanismos que
permiten a l usuario,
modificar l a posición
de l a cámara de f l u j o y t r a y e c t o r i a del haz
para a j u s t a r a l
máximo l a interacción de l o s mismos.
Las fuentes de l u z más u t i l i z a d a s
kriptón y lámparas
de mercurio.
longitud
apropiada para
de
onda
son láseres
de argón,
E l láser es ajustado
e x c i t a r un
a la
colorante en
p a r t i c u l a r . Los colorantes fluorescentes más u t i l i z a d o s son:
isotiocianato
de fluoresceina (FITC),
naranja de a c r i d i n a .
88
M. Sisteré
Cáncer de mama
f i c o e r i t r i n a (PE), Hoechst 33258, loduro de Propidium (PI) y
DAPI,
que
pueden
seleccionada
ser
excitados
a una longitud
por
de onda de
una
luz
láser
488 nanómetros, l a
más usada en l a práctica.
Cuando una luz
de
láser
incide
sobre
una
célula, se
obtienen simultáneamente t r e s parámetros:
1. -Forward s c a t t e r (Low-angle l i g h t scatter
a O grados):
Cuando una célula pasa a través d e l haz de l a luz d e l láser,
produce una
deflexión o dispersión
de l a luz en
un c i e r t o
número de grados. E l ángulo en e l que l a luz está dispersada
de
O
puede
grados es
ser
una medida
empleada
subpoblaciones
relativa del
para
celulares.
la
Por
tamaño celular y
resolución
ejemplo,
de
los
distintas
granulocitos
tienen un ángulo mayor de dispersión que l o s l i n f o c i t o s , l o s
monocitos y células plasmáticas tienen
Esta medida
se
r e a l i z a colocando un
otro lado de l a cámara de f l u j o ,
primaria d e l láser.
una barra de
intermedios.
fotodetector justo a l
por e l cual i n c i d e
En e l centro del
oscurecimiento
valores
l a luz
detector hay colocada
para e v i t a r que l a
luz incida
directamente sobre e l mismo.
2. -
L i g h t s c a t t e r a 90
propiedad refráctil de
grados (Right-angle
una célula es una
l a textura o granular!dad
scatter): l a
característica de
d e l citoplasma c e l u l a r
y se mide
por l a cantidad de l u z que l a célula dispersa a 90 grados de
l a fuente
presentan,
de
al
l u z excitadora.
Así
l a s células plasmáticas
i g u a l que l o s granulocitos,
mayor
señal de
side s c a t t e r que l o s monocitos o l i n f o c i t o s .
3. -
Fluorescencia
por l a propia
a 90
grados: La fuorescencia
célula (autofluorescencia)
89
emitida
o por colorantes
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
unidos a l a célula o componentes de l a misma,
fotodetectores
láser.
situados a 90
grados de l a luz incidente d e l
Las señales fluorescentes
por una
serie
de
fotomultiplicadores.
lentes
que
Filtros
es medida por
resultantes son recogidas
l a s conducen
especiales
se
hacia tubos
u t i l i z a n para
eliminar l a luz no deseada y seleccionar l a longitud de onda
apropiada para ser cuantificada.
Si l a s células sometidas a examen
tres
fluorocromos,
unidas con dos o
entonces podemos obtener varias medidas
simultáneas de una misma célula.
DNA (ploidía)
son
Por
ejemplo, contenido de
o posición d e l c i c l o c e l u l a r ,
y l a presencia
de marcadores específicos de s u p e r f i c i e .
Alternativamente,
puede
ser medida
utilizando
fluorocromos
l a presencia de dos
simultáneamente
anticuerpos
en
monoclonales
(con espectros de
o t r e s marcadores
una
misma
ligados
a diferentes
emisión diferente)
exciten por diferentes longitudes de onda
célula
que se
suministradas por
d i s t i n t o s láseres.118,119
90
M. Sisteré
Cáncer de mama
ENTRADA
nUESTRA
CELULAR
6 . - Partes
Figura
Citómetro
forma de
de F l u j o :
detalladas
y
funcionamiento
Las partículas entran
f l u j o laminar.
de
un
bajo presión en
A l s e r i n c i d i d a s por
e l láser, en
e l FALS se obtiene l a medida de tamaño, en 90e LIGHT SCATTER
l a grEinularidad c e l u l a r y en l o s detectores de f l u o r e s c e n c i a
las
señañes
originadas
colorantes.
Al
xm
piezoeléctrico
cristal
final,
de
la
tinción
e l f l u j o laminar
y
por diversos
es
d i v i d i d o por
l a s partículas
son cargadas
eléctricamente ( s o r t i n g ) .
91
M. Sisteré
Citometria de Flujo
3.- Análisis de l o s datos
Cuando l a célula pasa a través
de l a l u z d e l láser, l o s
transductores convierten l a s señales ópticas y fluorescentes
en pulsos eléctricos.
convertidos a forma
por
un
Estos son
amplificados, integrados y
d i g i t a l para que
computador.
Cada
célula
puedan ser analizados
es
evento de una intensidad determinada y
apropiado que es
proporcional
considerada
como un
colocada en un canal
a l a intensidad continua de
fluorescencia (o de otros parámetros). A p a r t i r de l o s datos
se
genera
(células)
un histograma que imprime e l número
por canal (intensidad).
(Fig.7
pueden ser mostrados de v a r i o s modos,
combinación
de
parámetros:
fluorescencia uno contra
for^vard
dos,
y
de eventos
8)
Los datos
comparando cualquier
contra
side s c a t t e r ,
intensidad de fluorescencia,
etc..
Uno
de
Citometria
l o s hechos
de
información
importantes
Flujo,
obtenida
discriminadas
es
(Forward versus
Side)
las otras subpoblaciones
los
l a posibilidad
a partir
por medio
de
de
de
sistemas
de
analizar l a
de subpoblaciones c e l u l a r e s
histogramas biparamétricos
mientras que l o s datos
son archivados.
obtenidos de
A este proceso se
l e llama "gatting". E l "gatting" es crítico para e l análisis
porque permite a l operador
examinar poblaciones específicas
y también ignorar señales generadas
bridas,
que f i j a n l o s fluorocromos de una
inespecíflea,
muertas y
manera intensa e
produciendo señales no deseadas. E l "gatting"
es también importante por que
humanas
por células
poseen
l a mayoría
autofluorescencia
92
de
las células
intrínseca,
l a cual es
M. Sisteré
Cáncer de i&aina
acentuada
en
l o s monocitos
y
granulocitos,
que
pueden
d i s t o r s i o n a r l o s resultados.
Otra función de los citómetros de f l u j o , es l a de separar
células después d e l análisis en
sus patrones
d i s t i n t o s grupos
en base a
A este procedimiento se
de tinción.
l e llama
"sorting".
La
separación
muestra
en
se
gotas
consigue
rompiendo
individuales
el
mediante
flujo
una
de l a
vibración
ultrasónica en l a cámara de f l u j o . Las gotas conteniendo l a s
células
son
través de
cargadas
un
positivas
electrostáticamente
d i s p o s i t i v o eléctrico.
para
cierto
marcador
Las
cuando
pasan a
células
o gotas
pueden
ser
eléctricamente y d i r i g i d a s en una dirección,
cargadas
ya que pasan a
través de placas de deflexión de a l t o v o l t a j e ;
mientras que
las células p o s i t i v a s para otro marcador pueden ser cargadas
negativamente y s e r
Las
deflexionadas
células s i n marcar con ninguno
en
dirección c o n t r a r i a .
de l o s dos fluorocromos
permanecen en e l f l u j o c e n t r a l o r i g i n a l .
Las
en un
células
80
(Fig.6)
obtenidas después d e l "sorting"
ó 90%
y pueden ser caracterizadas
son v i a b l e s
para análisis
funcionales posteriores.
4«~ Ventajas y l i m i t a c i o n e s
Las
frente
ventajas
a
otros
que
proporciona
métodos
93
que
la
Citometria
trabajan
con
de F l u j o
fluorocromos
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
incluyen:
-
La objetividad.
-
Una
mayor s e n s i b i l i d a d .
Una
elevada
velocidad
análisis de 100.000
P o s i b i l i d a d de
análisis
en
Determinar
la
una
mediciones
múltiples
célula.
densidad
a
(permitiendo e l
células por minuto).
realizar
simultáneas
(proporcional
de
antigénica
l a fluorescencia
por
emitida
célula
por l o s
colorantes unidos a l a partícula).
Posibilidad
de
detectar
células
raras
entre
una
población mayoritaria (1/1000 a 1/10000).
Las
-
desventajas
y
limitaciones,
incluyen:
Los
a l t o s costes
de intrumentación.
La
incapacidad
para
microscópicamente
en
visualizar
su
las
células
orientación r e l a t i v a
en un
tumor heterogéneo.
-
Los diferentes patrones de tinción fluorescente de l a s
células,
individual
tampoco
se pueden
distinguir
con l a citometría
de
flujo
de
un modo
(cómo e l
citómetro de f l u j o integra l a señal fluorescente t o t a l
de cada célula por su volumen,
una célula con un foco
teñido de un modo muy intenso va a generar igual señal
que una célula con una tinción difusa más d i s c r e t a ) .
94
M. Sisteré
Cáncer de mama
5.- Cuantificación
y
análisis
d e l contenido
en
DNA.
Estudio d e l c i c l o c e l u l a r
E l estudio del contenido en DNA puede l l e v a r s e
4
modos;
por
biología
cltomorfometría,
y por
de Flujo permite
la
rápido
a
celular,
cltogenétlca,
citometría de f l u j o . La Citometría
cuantificaclón
partir
a cabo de
de
del
pequeñas
DNA
de
muestras
un modo
celulares
y
blópslas.
La posición d e l c i c l o
c e l u l a r de las células normales o
tumorales puede obtenerse tiñiendo l a s células (sus núcleos)
con
sustancias
fluorescentes
estequiométricamenté a l DNA.
Propidium
Naranja
que
La Mitramicina
se
unan
y e l loduro de
tiñen células f i j a d a s no viables, mientras que e l
de
Acridina
y el
Bromuro de E t i d i o tiñen células
v i a b l e s . Seguidamente l a suspensión c e l u l a r es analizada por
el
Citómetro
fluorescencia
población
número
que
celular.
de
diploide),
y
depende
El
se
del
genera
DNA
histograma
(contenido
un
contenido
de
de
DNA
y e l número de células en
condensan los cromosomas
y
perfil
en
DNA
de
fluorescencia
(con un
en Fase S, donde l a s células
tetraplolde),
se
Flujo
células en Fase GO-Gl
sintetizando
cuales
de
de
la
da e l
contenido en DNA
están replicando o
entre
Fase
diploide
G2-M
ocurre
y
(en l a s
l a división
c e l u l a r ) . (Fig. 4)
Un
término
importante
que
se
describe
identificación de un contenido anormal en DNA es
índice de DNA
DNA de l a s
(ID), que es l a razón entre
células analizadas y
95
para
la
e l llamado
e l contenido de
e l contenido en DNA
de un
M. Sisteré
Citometría de F l u j o
cohorte de
células
células normales
euploldes /
euploldes.
diploides
El
c o n t r o l de l a s
se i d e n t i f i c a con un
I D de
1.00.
(ID)=Moda en canal de
GO-Gl
de l a muestra/moda en canal
de GO-Gl de células d i p l o i d e s
La
presencia
análisis
del
de
un
ciclo
proliferación
contenido
celular,
celular,
en
DNA
que
proporciona
anormal
en un
ligado
a
está
marcadores
la
sensitivos
adicionales de estados premalignos o malignos.
El
análisis
estudio
de
células,
informáticos
c o e f i c i e n t e de
se
suele
encuentran
variación de
programas
aneuploides y
DNA y d e l
ciclo
permiten
en
resultados d e l
celular
realizar
complejos que calculan e l
células que se
Estos
interpretación de l o s
d e l contenido en
población
de
y la
cada
l o s picos
estudiar
con
de una
programas
número y porcentage
fase,
en
así como e l
e l histograma.
también
los
picos
c a l c u l a r e l I D correspondiente.^8,119
6.- Nomenclatura de l a Citometría de F l u j o
En 1984,
nomenclaturas
se publicó una guía para
empleadas
Citometría de F l u j o .
en
el
u n i f i c a r l a s diversas
análisis
de
D N A mediante
Son cinco los puntos más importantes a
l a hora de r e a l i z a r un buen estudio citométrico.
96
M. Sisteré
Cáncer de mama
1. - Tinción d e l DNA.
E l Citómetro requiere
tinte
fluorescente
una tinción
que se
pueda
del
DNA
absorber
mediante un
por
e l tejido
tumoral.
2. - Diferenciación
entre
la
terminología
de
la
Citogenética y l a Citometria.
Se
recomienda,
hablar
cantidad
o
sobre
aunque pocas
términos
de
veces
se
Citometria,
se
cumple,
que a l
denomine
a la
de DNA como normal o anormal, en lugar de d i p l o i d e
aneuploide,
términos
embargo e l uso de estos
eminentemente
citogenéticos.
términos sigue muy
Sin
arraigado en l a
bibliografía, utilizándose todavía de forma h a b i t u a l .
3. - índice de DNA.
E l índice de DNA es l a media d e l contenido de DNA
de l a s
células que se encuentran en l a fase GO-Gl.
Las células con un
cariotipo
d i p l o i d e , tienen un índice
de DNA=1. La denominación de DNA einoinnal o "DNA aneuploide",
se debe
emplear cuando aparecen dos
picos GO-Gl, o cuando
e l índice de DNA es mayor de 1.
4. - Resultados de l a s mediciones citométricas.
Cada valoración de un tumor mediante Citometria de F l u j o ,
debe i n c l u i r e l c o e f i c i e n t e de variación de cada pico GO-Gl.
Considerándose mejor realizado e l estudio cuanto más pequeño
sea.
97
M. Sisteré
Citometria de Flujo
5.- Valores estándar pcira Citometria.
Las
células de
citométrico,
individuo.
r e f e r e n c i a ideales para un
buen estudio
han de ser d i p l o i d e s , d e l mismo t e j i d o y mismo
Pero
l a s más
habitualmente
utilizadas
e r i t r o c i t o s de ave o l i n f o c i t o s humanos.
98
M. Sisteré
son
Cáncer de mama
B.- APLICACIÓN DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN EL CÁNCER DE
MAMA
Mediante
contenido
ayuda
l a Citometría
de F l u j o ,
se puede conocer e l
de DNA de l a s células tumorales,
para
determinar
el
siendo de gran
comportamiento
de
cada
tumor.124-138
Los
datos del DNA
agresiva
índice
o
utilizados
tumoral mediante
para
medir
l a capacidad
l a Citometria de F l u j o
son; e l
de DWA, que permite d i f e r e n c i a r a l tumor en euploide
cuneuploide,
y e l porcentaje de células qpie
se h a l l a n en
fase de síntesis (Fase s).1^7,136
Los patrones de mayor
elevada
los
Fase
patrones
peqnueños
para
S
agresividad corresponderían a una
y una valoración
de menor
l a Fase
tumoral como Aneuploide,
agresividad
S
serían
l o s valores
y l o s tumores c l a s i f i c a d o s como
Diploides.
Existe una relación d i r e c t a entre l o s valores
elevados
y l a Aneuploidia con l a
Estrogénicos
tumoral
como
Negativos y
de Fase S
existencia de Receptores
una clasificación
histológica
carcinomas pobremente diferenciados
así como
con l a aparición de metástasis.
Acompañando l a Citometría de F l u j o a l estudio histológico
y a l de los receptores hormonales,
los
tumores de mama,
a l t o grado de r e c i d i v a
se pueden
conocer mejor
pudiéndose d i f e r e n c i a r los casos con
y así poder diseñar
99
un tratamiento
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
más adecuado. -^^^
La
utilidad
de l a Citometria
mama puede tener diversos
de F l u j o
enfoques.
en e l cáncer de
Se puede u t i l i z a r como
marcador de malignidad o f a c t o r pronóstico, a l dar una idea
más apropiada d e l potencial maligno de un cáncer después de
ser
diagnosticado.
citogenético,
capacidad
También
a l describir
agresiva
tiene
un papel
e l crecimiento
intrínseca
(fase S).
utilizada
para
caracterizar
células
marcador
tumoral
Y
hacia e l grado de diferenciación c e l u l a r ,
de
y la
además o r i e n t a
sobre todo a l s e r
en l a s enfermedades
malignas hematológicas. •'•^^
Con l a ayuda de l a Citometria de F l u j o ,
han d i v i d i d o
pronóstico,
a los
pacientes
en tres
según sea su ploidía y
algunos
tipos
La
con pronóstico
intermedio y pobre.-'••^^
Citometria
de F l u j o
como
tener poca relación con e l tamaño
de F l u j o es un
tumoral.
de d i s t i n t o
e l v a l o r de l a fase S.
De este modo se podrían encontrar pacientes
favorable,
autores
valor
pronóstico parece
tumoral. •'•^'^ La Citometria
f a c t o r pronóstico independiente
Nos informa de
porque estudia un
l a capacidad
agresiva
d e l tamaño
d e l tumor,
aspecto no morfológico y s i dinámico en
relación a l a biología tumoral.
Con l o s estudios d e l DNA c e l u l a r
mediante
Citometria de
F l u j o , se podrán b e n e f i c i a r aquellas pacientes que sufran un
cáncer de mama
s i n afectación
ganglionar
clínica, en l a s
cuales, mediante esta nueva técnica será posible d i s c r i m i n a r
las
candidatas
a una t e r a p i a sistémica
mayor riesgo de r e c i d i v a , ^-^^'
puedan
s e r tratadas
y apartar a l a s mujeres que
con métodos
100
a l comprobarse un
conservadores,
evitando
M. Sisteré
Cáncer de mama
tratamientos agresivos innecesarios.
En un primer momento se pensó que e l advenimiento
Citometria
de F l u j o sería
tratamiento
s e l e c t i v o de
Flujo
habría
de
de gran
fase
interés
celular.
ser un método
para
dar un
La Citometria de
ideal
determinar e l grado de sincronización
de l a
y
rápido
para
c e l u l a r . Se trataría
de s i n c r o n i z a r l a s células en l a misma fase c e l u l a r mediante
algunas sustancias como l a P r o l a c t i n a - * - ^ ^ ' y luego dar un
tratamiento quimioterápico que resultaría ser más r a d i c a l y
con menor cantidad de efectos
secundarios.
La Citometria de F l u j o es un arma
valoración
de l a e f e c t i v i d a d
considerada
como
uno de
monitorizar
l a respuesta
más a u t i l i z a r
de l o s tratamientos, está
l o s métodos
del
terapéutica radiactiva.-'•^'^
en l a
más e f e c t i v o s para
cáncer
de
mama
a la
Sin embargo esta opinión no está
unánimemente aceptada
Existen dos técnicas de Citometria para evaluar e l índice
de DNA y e l v a l o r de l a Fase S,
Flujo y
estudios
ciertas
l a Citometria
éstas son l a Citometria de
Estática. ^^^^ •'-^^'
l a flabilidad
Según algunos
es parecida,•'•^^'•'•^^
discrepancias, •'•^^
en otros hay
pero todos coinciden en que l a
Citometria de F l u j o es mucho más rápida
y
permite evaluar
mayor número de células.
Respecto
a l a sensibilidad
discrepancias.
Mientras
sensible, ^"^^^ ^"^9
Para
otros
de l a técnica,
algunos
creen
opinan
también hay
que
es muy
l o contrario.
comparar l a o b j e t i v i d a d de l a Citometria de F l u j o
se realizó en F i n l a n d i a un estudio de l o s mismos tumores
en
varios
laboratorios
101
diferentes,
observándose una
M. S i s t e c e
Citometria de F l u j o
correlación s i g n i f i c a t i v a para l o s valores de ploidía y fase
S, obtenidos en los diferentes c e n t r o s . ^ ^ l
Donde s i existe acuerdo es en relación a su u t i l i d a d para
determinar e l grado de heterogeneidad tumoral.
tener
muy en cuenta a
Es un dato a
l a hora de v a l o r a r unos resultados
procedentes de un estudio mediante
Citometría
de F l u j o , s i
se desestima podemos i n c u r r i r en un grave e r r o r .
La Citometría
Según
que
de Flujo presenta
autores,
algunas controversias.
encuentran
una
relación
poco
s i g n i f i c a t i v a , en relación a l a utilización de l a Citometría
de F l u j o como indicador pronóstico
la
necesidad de r e a l i z a r
para
Los
clarificar
estas
y diagnóstico, mostrando
mayor número
de investigaciones
dudas.1^^~1^0
estudios de Citometría de F l u j o en e l cáncer de mama,
pueden
hacerse
usando
tumores
guardados
en parafina,
congelados o en fresco,
mediante una punción-aspiración de
c é l u l a s , s i e n d o este
último método menos costoso
y con
una f l a b i l i d a d ligeramente superior, por tener que someterse
a menor tratamiento
enzimático,
evitándose
l a s frecuentes
i n t e r f e r e n c i a s por d e t r i t u s .
Otros
estudios
Citometría de Flujo,
linfocítica
se han llevado
a
cabo
analizándose e l grado
correspondiente
a
grado de diferenciación
de infiltración
l o s tumores
encontrarse relación entre l a infiltración
tumoral o e l
mediante l a
de mama, s i n
linfocítica y e l
estadio
clínico d e l
cáncer.
102
M. Sisteré
Cáncer de mama
C - PLOIDIA Y FASE S; Parámetros de u t i l i d a d clínica
Al estudiar e l DNA de l a s células mediante
l a Citometria
de F l u j o ,
se consiguen d e s c r i b i r dos parámetros de u t i l i d a d
clínica,
orientadores acerca d e l pronóstico y tratamiento a
seguir en e l cáncer de mama.
Estos dos parámetros son: l a Ploidía y l a Fase S.
1.- PLOIDIA
Mediante
l a Citometria
de F l u j o l o s tumores se pueden
c l a s i f i c a r como hemos v i s t o anteriormente en e l apartado de
l a nomenclatura.
Con un contenido
contenido anormal de DNA.
normal de DNA o con un
Refiriéndose
e l primero
a los
tumores diploides y e l segundo a l o s tumores aneuploides.
Se considera que un tumor es d i p l o i d e cuando e l índice de
DNA es i g u a l a 1, y sólo existe un p i c o GO-Gl.
Un tumor es aneuploide cuando e l índice de DNA d e l pico a
estudiar
es mayor de 1
o
hay a l menos
dos picos GO-Gl,
siendo e l índice de DNA d e l segundo pico d i s t i n t o d e l
valor
1. (Fig. 8 y 10)
Dentro de una población de células tumorales aneuploides,
se puede d i v i d i r a éstas en cuatro t i p o s atendiendo a l v a l o r
que adopte e l índice de DNA (ID) d e l pico GO-Gl:
Células hipodiploides.Células h i p e r d i p l o i d e s . -
103
ID < 1.
1 > ID < 1.9.
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
Células t e t r a p l o i d e s . - 1.9 > ID < 2.2.
Células h i p e r t e t r a p l o i d e s . - ID > 2.2.
Muchos estudios
de
mama,
realizados teniendo como
consideran l a ploidía
base e l cáncer
como un factor pronóstico
independiente.163-165
La
mayoría de
clasificado
como
investigadores
diploide,
consideran
que un tumor
tiene mejor pronóstico que uno
aneuploide,1^^~1^9 y con menor riesgo de recidivas.1^O,171
La determinación de
l a ploidía r
es de gran ayuda a l a
hora de administrar tratamiento coadyuvante
con
cáncer
positividad
de mama,
especialmente
ganglionar
y
a una paciente
cuando
l o s receptores
no e x i s t e
hormonales son
negativos.1^^
Según algún trabajo,
que
tienen
mayor
l o s tumores
facilidad
de r e c i d i v a r
tratamiento
radioterápico que l o s
explicación
la
aneuploides
tienen
justifican
d i p l o i d e s , parece s e r
tumores
diciendo
más s e n s i b i l i d a d
después
de un
aneuploides. La
que
l a s células
a l a s radiaciones que
l a s diploides.1^ ^
La ploidía tiene mayor significación pronostica cuando se
t r a t a de mujeres menopáusicas,
La aneuploidia
se ha observado
más frecuentemente en
tumores que tengan más de cuatro ganglios afectados y con un
intervalo
l i b r e de enfermedad
menor,
por l o que se puede
deducir que su vinculación está directamente
el
relacionada con
grado de malignidad.l^'*
Gracias a l estudio de
Citometría
de F l u j o ,
lesiones
se puede
biológica de l a lesión.
preinvasivas mediante l a
predecir
l a agresividad
Las lesiones aneuploides parecen
104
M. Sisteré
Cáncer de mama
tener una elevada agresividad.^'-'
Otra de l a s cualidades de l a
de
d i f e r e n c i a r metástasis.
encontrado
Citometria de F l u j o ,
Un mismo valor
en e l tumor p r i n c i p a l y
sugieren que éstas sean metástasis
en
es l a
de aneuploidía,
lesiones distantes,
d e l tumor primario
nuevas lesiones neoplásicas.
105
M. Sisteré
y no
Citoju^trla de
106
M.
Flajo
Sisteré
Cáncer de mama
107
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
2.- FASE S
Dentro d e l c i c l o c e l u l a r ,
que,
lejos
de
estar en
l a Fase S, es aquel periodo en
descanso,
l a célula presenta una
intensa a c t i v i d a d preparándose para l a mitosis.
La valoración d e l tanto por cien de células que se h a l l a n
en
esta
fase
mediante
ha
contribuido
métodos,
l a Citometría
de
enormemente
a
la
diagnóstico-pronostica d e l cáncer de mama.
que l a
determinación de
pronóstico
respecto
l a Fase
a la
S
Flujo
u otros
orientación
Se puede afirmar
tiene
supervivencia o
un
gran v a l o r
intervalo l i b r e
de enfermedad. 1'^^"181
La Fase
S,
noB
orienta
hacia
el
nivel
de a c t i v i d a d
p r o l i f e r a t i v a de cada tumor de mama.182
Para encontrar
una
valores
de
Fase S,
grupos.
Una
Fase
mayor
adecuación
es conveniente d i v i d i r a ésta
S pequeña
(<
(7-11.9%) y una Fase S elevada (>
El
valor
considerables
realizar
la
de
la
según
Fase
el
tinción
4',6'-Diamidino-2
pronostica
7%),
no
colorante
Phenylindole
en tres
Fase S mediama
12%).1^7,180
S,
del
una
a los
DNA,
sufre
que
se
como
modificaciones
utilice
por
Dihydrochloride,
para
ejemplo
loduro de
Propidium, Naranja de Acridina, o Ficoeritrina.183 ( p i g . 9)
108
M. Sisteré
Cáncer de mama
HISTOGRAMA DIPLOIDE
160
140
120
100
Figura 9.- Área que abarca la fase S
109
M. Sisteré
JUSTIFICACIÓN
DEL TRABAJO
C i t o n ^ t r i a de F l u j o
JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
E l cáncer
en
base
de mama en l a actualidad se valora y
a un concepto estático
estadiaje clásico del
TNM y
de tumor,
otros
como son l a invasión perivascular,
la
necrosis
intratumoral
se t r a t a
definido por e l
parámetros i n d i r e c t o s ,
l a invasión perineural,
o l a embolización linfática por
parte de l a s células neoplásicas.
En
base
tratamiento
a estos
caso,
mencionados
determinados
mencionados,
se elabora
un
que se ha de basar en una s e r i e de parámetros
demasiado poco
cada
datos
flexibles,
agrupando
a
parámetros
niveles
que no permiten i n d i v i d u a l i z a r
l o s pacientes
indirectos
o
grupos
por
y
l o s antes
estáticos
correspondiéndoles
en
un
tratamiento ya preestablecido.
En contra
analizar
de l o anterior,
l a biología
tumoral,
parámetros de t i p o d i r e c t o ,
cada célula y e l
con este trabajo
mediante
se pretende
una s e r i e de
como es e l contenido
en DNA de
grado de diferenciación,
de repllcaclón o
de a c t i v i d a d d e l material genético c e l u l a r
tumoral, para de
este
modo,
mediante
un concepto
dinámico
de biología
tumoral, comprender mejor e l comportamiento de cada tunKJr de
mama y así poderse r e a l i z a r
una determinación
pronostica y
terapéutica mas acertadas.
110
M. Sisteré
Cáncer de mama
Entendiendo de esta manera e l comportamiento tumoral; de
forma
dinámica
conceptos como
aparición,
y no estática,
nos podremos
l a h i s t o r i a natural d e l cáncer
su evolución (oncogénesis),
adentrar en
de mama, su
haciendo más lógico
e l tratamiento.
111
M. Sisteré
OBJETIVOS
Citometria de F l u j o
OBJETIVOS
Los objetivos que buscamos en este trabajo son:
1. - Valoración de
variables
cáncer
y
utilidad
clínico-patológicas,
clásicamente
mama,
l a significación
como
de v a l o r pronóstico
son: Edad,
de mama,
antecedentes
consideradas
en e l cáncer de
antecedentes
antecedentes
de l a s
f a m i l i a r e s de
personales mamarios,
ginecológico-obstétricos,
Receptores Tumorales de Estrógenos
TNM,
y Progesterona
y
tratamientos coadyuvantes recibidos{QT, HT, RT).
2 . - Estudio
de
l a cinética
mama mediante
Citon^tría
celular
de Flujo.
contenido de DNA (ploidía)
d e l cáncer
de
Valoración d e l
y fase de síntesis de DNA
(fase S ) .
3. - Comparar l a u t i l i d a d de estos parámetros clásicos con
los nuevos
factores
como son l a ploidía
celular o
fase
S,
dinámicos de biología tumoral,
y
e l índice
obtenidos
de proliferación
mediante
técnicas de
Citometría de F l u j o .
112
M. Sisteré
Cáncer de mama
4 . - Relacionar estos valores
supervivencia,
pacientes
posible
subgrupo
permitiría
de
de mama,
riesgo
en Estadio
I
d e f i n i r dos nuevos
(ploidía y fase
pronóstico
evolutivo y
con e l f i n de discriminar mejor a l a s
con cáncer
clasificados
con e l curso
estableciendo
entre
l o s tumores
(TINOMO).
Lo cual nos
parámetros biológicos
de síntesis de DNA),
como de v a l o r
independiente.
113
un
M. Sisteré
MATERIAL Y
MÉTODO
Citometría de F l u j o
MATERIAL Y MÉTODO
A.-
1.-
Se
de
SUJETOS DEL ESTUDIO
Definición de l a población a estudiar
han
cáncer
seleccionado
de mama,
232
pacientes
hembras,
afectas
con edades comprendidas entre 29
y 85
años.
No se
ha
tenido
(urbana/rural),
profesión
o lugar
en
cuenta
n i e l estatus
de
trabajo
n i e l lugar
de residencia
soclo-económlco,
de
l a s pacientes,
ni la
n i los
hábitos a l i m e n t i c i o s , n i tóxicos de éstas.
La inmensa mayoría
de l a s pacientes residen
en una zona
de clima continental.
114
M. Sisteré
Cáncer de mama
2.-
Definición
de l o s
individuos
del
trabajo
de
investigación
2a.-
Selección de l o s pacientes
De forma Individual y para cada paciente
se han recogido
l o s datos correspondientes a:
a/ Edad.
b/ Antecedentes Familiares de Cáncer de Mama.
c/ Antecedentes
menarquia,
Personales
Ginecológicos ( edad
fórmula menstrual,
años de menopausia,
de embarazos
de l a
edad de l a menopausia,
edad del primer
embarazo, número
y l a c t a n c i a t o t a l en meses ).
d/ Antecedentes
Pe'rsonales
de
Patología
Mamaria
(incluyendo e l t i p o de patología mamaria).
e/ Fecha de l a Intervención.
f/ TNM histológico correspondiente a l tumor,
g/ Tipo Histológico d e l cáncer resecado.
h/ Estudio Histológico de
si
había
Perineural
o
e
l a masa extirpada, incluyendo
no Necrosis
Invasión
Intratumoral,
Perivascular.
Invasión
Además
de l a
afectación ganglionar correspondiente, determinando e l
número de ganglios invadidos d e l t o t a l de estudiados y
anotando
s i existían
ganglios
con H i s t i o c i t o s i s
Sinusal.
1/ Estudio d e l tipo de Receptores Hormonales.
j / Tratamiento recibido
con
e l número
postintervención
de rads t o t a l e s y
115
( radioterapia
campos irradiados.
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
quimioterapia especificando los
fármacos
empleados y
l a duración, hormonoterapia con e l fármaco u t i l i z a d o ) .
k/ Recidivas
del
seguimiento y
proceso
e l lugar
lecho c i c a t r i c i a l ,
1/ Metástasis
neoplásico
donde
durante
aparecieron
el
( axila,
piel,...).
y lugar de
afectación
( pulmón, huesos,
hígado, cerebro, y otras ).
m/ Patología de l a mama c o n t r a l a t e r a l en e l momento d e l
diagnóstico
y
intervención (
tumor
se
en
e l seguimiento después
tumoral o i n f e c c i o s a ,
especificaba
si
de l a
s i aparecía un
era
sincrónico
o
metacrónico ).
n/ Marcadores Tumorales. Los únicos valores obtenidos han
sido l o s correspondientes a CEA y CA 15.3.
o/ Días de supervivencia desde l a intervención.
E l seguimiento ha oscilado entre 2
y 23 años, siendo
l a media de 8-9 eiños.
2b.-
Recogida d e l material
Del
archivo
de
tumores
Patológica d e l Hospital
para
cada
uno
de
d e l Servicio
Arnau de
Vilanova,
l o s pacientes,
de
Anatomía
se obtuvieron,
entre
cuatro
y ocho
muestras tumorales, guardadas en bloques de parafina.
Las
muestras
correspondían
ganglios
axilares
s i estaban
tumorales
y a metástasis,
116
a l tumor
original,
infiltrados
caso de
a los
por células
que hubieran,
así como
M. Sisteré
Cáncer de mama
bloques correspondientes
a recidivas del mismo
paciente y
ganglios afectados en esas r e c i d i v a s .
Correlacionándose
consiguieron
las
con cada
bloque
correspondientes
de
p a r a f i n a , se
preparaciones
de
Hematoxilina-Eosina.
2c.-
a/
C r i t e r i o s de inclusión
Reunir
todos
los criterios
establecidos
en l a
selección de pacientes (Pag. 116-117).
b/
Encontrar
cantidad
e l material
adecuada
en
para
buenas
obtener
condiciones y en
s u f i c i e n t e muestra
tumoral y no i n u t i l i z a r e l bloque de parafina, por s i
tuvieran que r e a l i z a r s e futuras preparaciones.
2d.-
Una
C r i t e r i o s de exclusión
vez reunidos l o s casos para r e a l i z a r e l estudio, y
teniendo en cuenta una e s t r i c t a
utilización d e l
método, se
han ido descartando pacientes por los siguientes motivos:
1.-
Escasez de m a t e r i a l :
e l momento de
realizar
Ya sea por f a l t a de muestra en
l o s cortes,
o por perderse en l o s
siguientes procesos:
- Desparafinización.
- Trituración.
117
M. Sisteré
Citometría de Flujo
- Centrifugado.
2. - Problemas
surgidos
en
el
procesamiento
de
las
muestras mediante e l Citómetro de F l u j o ;
- Déficits de tinción, siendo interpretado por e l
Citómetro de Flujo como f a l t a de muestra.
- Dificultades inherentes d e l aparato como:
Alteraciones en l a calibración.
Alteraciones en l a potencia d e l láser.
- Exceso de d e t r i t u s .
3. - Problemas en l a interpretación de l o s resultados;
- Histogramas deformes. ( F i g . 11)
- Exceso
de
casos
detritus
(de
nuevo
por este motivo por
valoración
objetiva y
se eliminaron
r e a l i z a r s e una
estricta
a cargo
del programa de interpretación de DNA).
- Defectuosa interpretación de los histogramas.
- Coeficiente
de
variación
de
l o s histogramas
superior a 8.
2e.-
T a m a ñ o de l a muestra
E l estudio se ha realizado con 232 pacientes.
Tras
criterios
una
rigurosa
expuestos
selección
de
anteriormente,
pacientes
se
llevó
según
a
cabo
proceso d e l material tumoral en 172 de e l l a s .
118
M. Sisteré
los
el
Cáncer de mama
Se ha procesado por c i t o m e t r i a de
maestras
correspondientes
a
f l u j o un
tumor
t o t a l de 345
primario,
ganglios
a x i l a r e s invadidos, metástasis, r e c i d i v a s locorregionales
ganglios
axilares
correspondientes
a
estas
y
recidivas,
realizándose en cada una de e l l a s los mismos procedimientos.
Para e l
estudio f i n a l estadístico,
se
han
admitido un
t o t a l de 107 pacientes correspondiéndoles 180 muestras.
E l número de pacientes a l a s que se l e s
ha estudiado
la
afectación ganglionar ha sido de 56, y l a s metástasis de 9.
2f.-
Grupo c o n t r o l
Para saber l a ubicación d e l
histograma;
y de
esta
pico
diploide
manera orientarnos
{2n)
en e l
para conocer e l
índice de DNA de l a s muestras a estudiar, se emplean células
que estén en
una
proporción
muy
baja
de
mitosis. Estas
células suelen ser normalmente e r i t r o c i t o s de p o l l o , células
no tumorales del propio paciente o l i n f o c i t o s .
En este trabajo se
han u t i l i z a d o l i n f o c i t o s
de donantes
asintomáticos.
Los l i n f o c i t o s
se
han de
separar d e l resto
sanguíneas y suero mediante e l empleo de
de células
f i c o l l (método que
se describe a continuación).
119
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
FL2
1
2
3
4
MIN
170
188
336
606
MAX
211
299
377
647
m
m
90
lio
168
366
131
165
229
407
COUNT
5789
1364
742
45
PERCENT
35.6
8.4
4.6
0.3
MEAN
178.3
226.0
348.8
627.8
FL2
1
7
3
4
Fig.
COUNT P£RC£?iT
4263
21.3
2268
11.3
4334
21.7
381
1.9
101.5
140. B
201.4
382.3
SD
8.2
36.7
9.7
10.1
SD
10.2
16.5
10.8
11,8
% HPCV
5.14
12.5
2.34
0.12
% HPCV
9.20
15.3
7.84
1.68
10.- Histogramas de nuestra casuística
1. - Histograma d i p l o i d e
2. - Histograma aneuploide
120
M. Sisteré
Cáncer de mama
ftlN
176
¡86
t.78
m\
217
329
389
719
C0UH7 PERCEfiT
2279
tl.4
4619
23.1
2771
13.9
303
1.5
HIN
HAX
CaUNT
86
326
462
574
127
367
503
615
MEAN
193.2
254.3
3Ó7.2
697.8
SD
12.1
48.3
11.8
12.4
I HPCV
10.9
11.4
9.02
0.28
HEAN
SD
ü HPCV
104.8
346.5
481.0
593.4
12.1
12.2
12.0
12.7
c
o
ü
N
T
FLZ
1
2
3
4
PERCENT
620
1047
834
264
5.0
8.5
ó.6
2.1
2.31
2.28
0.58
0.75
F i g . 11.- Histogramas anómalos de nuestra casuística
1. - Histograma con c o e f i c i e n t e de variación excesivo
2. - Histograma con exceso de d e t r i t u s
121
M. Sisteré
Citometria de F l u j o
B.-
TÉCNICAS E IHSTRüMEMTOS ÜTIItlZADOS
E l instrumento u t i l i z a d o para
realizar
este
trabajo de
investigación se denomina CITÓMETRO DE FLUJO.
E l Citómetro de F l u j o
equipa un Rayo Láser
u t i l i z a d o es un Epics
como
Pro f i l e que
fuente de energía.(Fig, 12,13,14
y 15)
Las
bases
técnicas
esquemáticamente,
se
Citómetro de F l u j o es
que
mediante
la
de
un
detallan
Citómetro
en l a f i g u r a
un contador de
incidencia
d e l rayo
de
6.184,185
células o partículas,
láser
determina una s e r i e de cualidades susceptibles a
con un
s i g n i f i c a d o propio,
ya
Flujo
expuestas
en
sobre e l l a s ,
medición y
un capítulo
anterior.
E l trabajo se ha r e a l i z a d o tomando como
empleados
con
leves
por H e d l e y ^ ^ ^ ^ y
remodelaciones
o
base los métodos
otros investigadores!^^'
variaciones
que
se
citan a
continuación.
Entre
trabajos
estas
diferencias
se
de van Driel-RuUcer^^^
ha
seleccionado
de
y Oud,^^^la utilización de
una tinción con Hematoxilina-Eosina
para seleccionar e l área
de invasión tnmoral. ( F i g . 16 y 17)
122
los
M. Sisteré
Cáncer de naM,
Figmra 12.- Clt(^»tro €e FlnJ©
123
m. Sisteré
C i t o K t r i a de F l u j o
124
M. S i s t e r f
Cáncer de Maaia
Fifíira 14.- CltÓMtro
realiza
de
la
Finjo.
lectiira
Cá«ara
al
donde e l láser
incidir
sobre l a s
partículas.
125
M. S i s t e r e
Cito»etrIa de Flmjo
Figura 15.- CitÓKtro
de
Finjo.
Detalle
de
les
f o t O M i l t i p l i c a d o r e s , encargados d.e a i ^ l i f i c a r
y 1;ransfor«ar
procedente
en tma señal
de
las
analógica l a l a z
partículas
c o n f e c c i o n a r un lilstogra»a.
12S
m. Sisteré
para
Cáncer de mama
C-
PIAMTEAMIENTO METODOIX)GICO
1.-
Obtención de l a muestra
Es una parte muy
importante d e l método.
una meticulosa selección
cada
bloque
de
mieras
de grosor;
ayuda
de
una
de l a zona
parafina.
Se ha realizado
propiamente tumoral en
Mediante un
corte de
t a l como recomienda Heiden,!^^
preparación
delimitó con exactitud
en
de
cada
unas 100
y con l a
Hematoxilina-Eosina,
corte
el
se
área tumoral,
desechándose e l r e s t o de t e j i d o no tumoral.
Con e l apoyo de
se
suprimen
tumorales
una preparación
las interferencias
que darían
un
de Hematoxilina-Eosina,
causadas
registro falso
aspecto que no se tiene en
por células no
en e l histograma,
cuenta en numerosos
trabajos de
citometria de f l u j o publicados.-'•^'^"l-^^'
Este
método se d e t a l l a en
l o s trabajos
de Driel-Kulker
e t a l . y Oud e t al.(190 y 191 de l a bibliografía.).
(Figuras 16, 17)
127
M. Sisteré
CitOT»t.ría de F l u j o
F i g a r a 16.- Prej^ración
de
fcBatoxilina-E©siiMi
u Aspecto «icroscépico. (4 X)
12i
Cáncer úm mama.
F i f u r a 17.- Preparación
dfe Hematoxilina-Eoslma
de
nm
ganglio invadid© por célmlas pertenecientes a
un cáncer de mm&.
Aspecto microscópico.
(18 X)
129
M. Sisteré
Fly UP